Свободно-радикальное окисление как фактор изменения функционального состояния белковых молекул

Актуальность исследования. С середины прошлого века произошел весомый прогресс исследований в области свободно-радикальной биологии и медицины. Непосредственно расширился спектр заболеваний и патологических состояний, связанных со свободными радикалами. В данный момент проблема изучения механизмов развития окислительного стресса является актуальной для медицинской науки, так как затрагивает значительное количество патологий, имеющих социальную значимость.

Цель исследования – установить значение влияния свободно-радикального окисления на структуру и функции белков.

Анализ и его обсуждение.

Белки известны как главные мишени для действия активных форм кислорода (АФК) и азота (АФА) из-за высокой чувствительности к свободным радикалам [7], а также распространенности в биологических материалах. Непосредственно они отвечают за большинство процессов в клетках, вследствие чего изучение их окислительного повреждения имеет огромное значение [7]. Окислительная модификация белков представляет собой процесс их ковалентного преобразования, который вызван прямым воздействием АФК или АФА, и косвенным взаимодействием с вторичными побочными продуктами окислительного стресса [9].

Правда ли, что свободные радикалы действуют только негативно? Свободные радикалы имеют ряд полезных и важных функций. Например, радикалы убихинона принимают участие в транспорте электронов в дыхательной цепи а радикалы оксида азота влияют на тонус сосудов и обладают регуляторными функциями: способствуют накоплению в клетках вторичных мессенджеров – циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ), депонированию ионов Са²⁺ в цитозоле и стимулируют фосфорилирование белков. Под влиянием АФК происходит инициация процессов белкового синтеза, ведущая к образованию апоптических белков, сосудистого эндотелиального фактора роста, сосудистого фактора проницаемости. Следовательно, свободные радикалы принимают участие в формировании воспалительного и иммунного ответа организма.

Также известно, что обилие свободных радикалов и продуктов перикисного окисления липидов вызывает структурные и функциональные повреждения биологических мембран, что имеет непосредственное влияние на активность ферментов, нуклеиновых кислот, белков, липидов и т.д. Так, например, О2˙ ̄ окисляет SH-группы в составе белковых соединений, вызывает повреждение кoллагеновых структур, депoлимеризацию гликoзаминогликанов и кислых полисахаридoв, инактивирует каталазу, глутатиoнпероксидазу, Са²⁺-АТФ-азу сoсудистой стенки, угнетает транспорт ионов кальция. Он окисляет фосфолипиды клеточных мембран и ускоряет разрушение клеток, выход лизосомальных ферментов и образование цитокинов. Взаимодействие О2˙ ̄ с NO^• приводит к образованию сверхтоксичного пероксинитрита ONOO ̄ , который повреждает клетки эндотелия, нарушает регуляцию кровяного давления, индуцирует апоптоз.

Взаимодействие свободных радикалов и образовавшихся продуктов с белками ведет к их полимеризации и утрате биологической активности, нарушению проницаемости для ионов Н⁺ ОН^- и Са²⁺. Ускорение ПОЛ в мембранах вызывает обеднение микроокружения белков непредельными липидами.

Изменение физико-химических свойств биомембран ведёт к повреждению рецепторного аппарата клеток, и изменяет их специфические функции. При многих заболеваниях, различных по этиологии и патогенезу, при действии негативных факторов среды (ультрафиолетового облучения, ионизирующей радиации, ксенобиотиков, техногенных загрязнителей атмосферы и т.д.) создаются благоприятные условия для нарушения стационарного состояния свободно-радикального окисления. Оно может быть связано с различными причинами. Большое значение имеют избыточное появление инициаторов СРО, снижение эффективности механизмов регуляции СРО, количественные и качественные изменения субстрата окисления. Существует много данных об изменении этого процесса в организме при разнообразных заболеваниях: язвенной болезни, диабете, опухолях, инфаркте миокарда, инсульте, паркинсонизме, эпилепсии, рассеянном склерозе, заболеваниях крови, системных заболеваниях. Нарушение СРО может стать истинной причиной развития патологического процесса или ухудшить течение заболевания.

Из этого следует, что процесс СРО необходим и в то же время опасен для организма. Его замедление или ускорение может явиться начальным звеном развития различных заболеваний. К примеру, при недостатке оксида азота, регулирующего тонус сосудов, вызывается гипертония, а при избытке – гипотонию.

Каков механизм повреждения белков?

α-атом углерода любого из аминокислотных остатков атакуется гидроксил-радикалом, который извлекает водородный атом, что приводит к образованию алкильного радикала и воды. Образовавшийся алкильный радикал может присоединять молекулу кислорода с образованием алкилперокислого радикала, который далее реагирует с протонированным супероксид-анионом (НО•2), либо же с Fe²⁺ и H⁺. В свою очередь алкилпероксид может реагировать с (НО•2) или с Fe²⁺ и H⁺, образуя алкоксирадикал. Протонированного супероксида или Fe²⁺ и Н⁺ могут вызвать ещё одно окисление пептида до его гидроксилпроизводного или вообще привести к разрыву пептидной связи. Алкил-, пероксил- и алкоксильные радикалы пептидов тоже могут извлекать атомы водорода из аминокислотных остатков, генерируя новые радикалы. Недостаток или полное отсутствие О₂ может спровоцировать взаимодействие алкильных производных и привести к образованию внутри- и/или межпептидных сшивок.

Кроме изменения пептидной цепи простых белков при взаимодействии с прооксидантами модификации могут подвергаться небелковые части сложных белков [5]. Например, модификация простетической группы, содержащей негемовое железо, сопровождается диссоциацией ионов железа от белка. 

Структуры полипептидной цепи меняется, сопровождается модификацией пептидной связи и боковых радикалов аминокислот [8]. Окислительная атака способствует образованию углеродного радикального центра за счет реакции с ОН• α-водородного атома аминокислотного остатка, что в конце концов, приводит к разрыву пептидных связей [5].

Ученые уделяют большое внимание окислительной модификации белков активными формами кислорода в присутствии металлов переменной валентности (медь, железо). Такой процесс называется металл-катализируемым окислением белков [5]. Металл-катализируемое окисление – это сайт-специфический процесс, происходящий в области металл-связывающей поверхности белка, в которой и осуществляется модификация аминокислотных остатков [5]. Таким образом, окисление белков по металл-зависимому механизму возможно в случае простых белков при наличии металл-связывающей поверхности [5]. Но при этом в случае сложных белков, имеющих в качестве простетической группы металл переменной валентности, окисление будет при условии доступности данного участка для пероксида водорода. Генерация ОН• за счет металл-катализируемой реакции происходит на ограниченном участке, вызывая окислительную модификацию близлежащих аминокислотных остатков [6].

Важную роль в свободнорадикальном окислении белков имеют ионы железа, которые выступают донорами электронов, непосредственно, инициируя данный процесс. В некоторых патологических случаях ионы железа могут высвобождаться из клеточных депо, что приводит к нарастанию свободнорадикальных процессов с вытекающими последствиями.

Одним из механизмов металл-катализируемого окисления может быть взаимодействие остатка лизина с ионом Fe²⁺, в результате которого образуется Fe2+-белковый координационный комплекс. Ион металла, соединенный с металл-связывающей поверхностью белка, реагирует с пероксидом водорода, что приводит к генерации реакционноспособных соединений, способных разрушать металл-связывающую поверхность белка и диссоциировать Fe²⁺ –белковый комплекс [4,5]. Итогом этих превращений является окисление аминокислотных остатков и образование карбонильного производного, в этом случае альдегидного.

Большинство аминокислотных остатков подвергаются окислению гидроксильными радикалами, но только в некоторых случаях установлена природа образуемых веществ.

Фенилаланин может превращаться в мoно- и дигидроксипроизводные, а тирозин в 3,4-дигидроксипроизводное, также эти вещества могут подвергаться обратному окислению/восстановлению и генерировать АФК. Формирующиеся при окислении тирозина радикалы также могут взаимодействовать между собой и образовывать дитирозины, которые приводят к появлению внутри- и межмолекулярных сшивок пептидов. Наличие 2,2ʹ-бифенильных производных служит маркером индуцированных АФК повреждений белков.

На данный момент известно про существование двух изоформ аконитатгидратазы: цитоплазматической и митохондриальной. Несмотря на различные физико-химические и структурные свойства, оба изофермента аконитатгидратазы имеют железо-серный кластер, связанный с остатками Cys437, Cys503 и Cys506 [3]. Установлено, что при окислительном стрессе разрушается железо-серный кластер аконитатгидратазы, что приводит к инактивации фермента.

В литературе упоминается о непосредственном участии супероксидных анион-радикалов в разрушении железосерных кластеров аконитазы, что приводит к инактивации фермента. Известно, что цитоплазматическая и митохондриальная формы аконитатгидратазы могут выполнять различные физиологические функции, которые соответствующим образом связанны с их участием в окислительных и биосинтетических процессах. Реакция, катализируемая митохондриальной аконитатгидратазой, служит начальным этапом цикла Кребса. Данный изофермент чрезвычайно чувствителен к активным формам кислорода, причем в большей степени, чем цитозольная форма [1,2]. Супероксид, образующийся в электрон-транспортной цепи митохондрий, вероятно, может уменьшать активность митохондриальной аконитатгидратазы, что сопровождается замедлением цикла трикарбоновых кислот и снижением потока электронов через митохондриальную дыхательную цепь. Действие цитоплазматической аконитатгидратазы связано с регуляцией накопления и утилизации цитрата в процессах липогенеза и синтезом глутамата. Предшественник глутамата – это 2-оксоглутарат, образующийся под действием цитоплазматической НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из изоцитрата, источником которого служит реакция, катализируемая цитозольной формой аконитатгидратазы.

Выводы. Окислительной модификации белков подвержены простые и сложные протеины. При этом структурно меняются все аминокислотные остатки в полипептиде. Образование карбонильных групп (альдегиды и кетоны) является общим признаком окисленных белков. При свободно-радикальной патологии в окислении участвуют большое количество аминокислот, что может привести к потере или приобретению их флуоресцирующих свойств. Возможна химическая фрагментация белков, ковалентные реакции и гидрофобные взаимодействия с соседними белками. Образующиеся белок-белковые сшивки устойчивы к протеолизу, а накопившиеся фрагменты имеют токсическое действие. Накопление белковых агрегатов и фрагментов может нарушать метаболические процессы в клетке, что может привести к апоптозу или некрозу клетки. Окислительная модификация белков, приводящая к изменениям вторичной и третичной структуры, может нарушить функциональную деятельность белка. Вместе с тем, не каждая окислительная модификация аминокислотных остатков может явиться губительной для функционирования белка. При этом, новые производные могут включаться в дальнейшие метаболические пути организма.

В целом, окисление белков является неотъемлемой составляющей их обмена в организме. В процессе свободного окисления протеинов можно выделить три варианта развития:

1. Более глубокое повреждение частично окисленного белка, способствующее его агрегации или фрагментации и непосредственному накоплению модифицированных протеинов в клетке. В большинстве случаев, подобные структуры высокоустойчивы к протеолизу и имеют токсические свойства, что, в свою очередь, может привести к апоптозу или некрозу клетки.
2. Репарация с образованием первоначальной формы белка. Данный путь свойственен для окисленных форм цистеина и метионина.
3. Разрушение модифицированных белков протеасомами или протеазами с образованием пептидов, которые могут пойти на синтез новых необходимых клетке протеинов.