Хромато-масс-спектрометрическое определение маркеров токсичных ксенобиотиков в биологических объектах

С применением методологии сопоставительного анализа на основе эталонных показателей процесса определения, рассмотрено выявление токсичных ксенобиотиков и их маркеров в биологических объектах методом хромато-масс-спектрометрии. Представлены примеры эффективного использования функционала различных способов пробоподготовки и выделения целевого аналита из биологических матриц для их последующей идентификации методом хромато-масс-спектрометрии. Показана эффективность подхода, основанного на применении метода хромато-масс-спектрометрии с различными способами ионизации (электронная ионизация, химическая ионизация, электрораспылительная ионизация, фотоионизация) для определения ксенобиотиков органической природы и их маркеров в биологических объектах (кровь, моча, слюна, молоко, волосы, органы и ткани) на уровне следовых содержаний, влияющих на биомедицинские параметры организма.

Аннотация статьи
сопоставительный анализ
ксенобиотики
токсикологический контроль биологических объектов
хромато-масс-спектрометрия
маркер
безопасность жизнедеятельности
экотоксиканты
Ключевые слова

Модернизация научных процессов способствует росту и развитию инновационного потенциала научных организаций, проектированию новых научных знаний. В этой связи сопоставительный анализ представляется эффективным средством изучения и адаптации наилучших методов достижения высоких научных показателей, создания эталона оценки для совершенствования собственных результатов [1].

Цель настоящей работы состоит в применении методологии сопоставительного анализа для оценки перспектив применения метода хромато-масс-спектрометрии (ХМС) при определении токсичных ксенобиотиков и их маркеров в биологических объектах.

Контроль содержания в биологических объектах ксенобиотиков и продуктов их биотрансформации (маркеров), представляющих реальную угрозу безопасности жизни и здоровью человека является в настоящее время актуальной проблемой. К ним относятся: природные и синтетические психоактивные и ядовитые вещества, малоизученные новейшие лекарственные препараты, продукты биотрансформации органических поллютантов различных классов, вторичные метаболиты продуктов жизнедеятельности плесневых грибов (микотоксины) и др. Актуальность выявления маркеров токсичных ксенобиотиков в биологических объектах обусловлена:

  • необходимостью раннего предупреждения возникновения новых потенциальных угроз безопасности жизнедеятельности;
  • заблаговременной биомедицинской диагностикой их негативного воздействия и предотвращения необратимых последствий на живой организм, результатом которых являются токсикозы не выявленной этиологии с летальным исходом;
  • разработкой и принятием необходимых нормативных правовых актов, направленных на минимизацию угроз, в том числе их бесконтрольного применения либо распространения.

Широкое применение для решения этих задач в настоящее время находят методы хроматографического разделения в сочетании с масс-спектрометрическим (МС) детектированием, основанные на принципах газовой хроматографии (ГХ-МС) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-МС), в том числе с использованием ее тандемного варианта (ВЭЖХ-МС/МС) [2]. При этом объектами химико-аналитического и биомедицинского контроля являются:

  • биологические жидкости человека (кровь, моча, слюна, пот, меконий), волосы, срезы свободных частей ногтевых пластин пальцев рук, органы и ткани;
  • биологические жидкости животных (кровь, моча, молоко), органы и ткани.

При этом основные направления прикладного применения ХМС направлены на выявление в биологических объектах:

  • веществ и препаратов (в том числе психоактивных), их аналогов и прекурсоров, находящиеся под специальным международным и национальным контролем;
  • ядовитых и сильнодействующих веществ, включенных в международные и национальные списки соответствующих конвенций;
  • стойких органических поллютантов, а также микробных маркеров.

Сопоставительный анализ высокочувствительного ХМС определения популяционных веществ-маркеров, аналитические характеристики методик определения и используемые для этого способы пробоподготовки рассмотрены ниже на примере веществ, представляющих интерес с точи зрения их токсикологических параметров и значения их биомедицинского контроля в биологических объектах.

С развитием ХМС скрининга для предупреждения роста злоупотреблений психоактивными веществами, например, содержащими фитоканнабиноиды (ФК) либо синтетические каннабимиметики (СК) – агонисты каннабиноидных рецептов, были получены результаты изучения влияния химической структуры этих соединений и продуктов их биотрансформации на их токсикологические свойства. Было установлено, что основными мишенями ФК - D9-тетрагид-роканнабинола (D9-ТГК) и СК различных классов (циклогексилфенолы, нафтоилиндолы, фенилацетилиндолы, бензоилиндолы, индол- и индазол-3-карбоксамиды, индол-3-карбоксилаты и др.) в организме являются каннабиноидные рецепторы CB1i=10 нМ), располагающиеся, главным образом, в клетках ЦНС и CB2, экспрессирующие в клетках иммунной системы. Психоактивный эффект ФК и СК связан с активацией CB1- и CB2-рецепторов, что ведёт к ингибированию аденилатциклазы и уменьшению концентрации вторичного мессенджера циклического аденозилмонофосфата.

При ГХ-МС исследовании биологических объектов от лиц, употреблявших Cannabis, было установлено, что в организме человека D9-ТГК быстро метаболирует до двух основных соединений: 11-нор-9-карбокси-D-9-тетрагидроканнабинола (11-СООН-TГК, основные целевые ионы масс-спектра, m/z(Да): 413, 515, 572) и 11-гидрокси-D-9-тетрагидроканнабинола (11-ОН-TГК, m/z: 371, 474, 459), являющихся маркерами употребления ФК. Проведение реакций метилирования, силилирования и ацетилирования с применением различных дериватизирующих агентов и таких способов пробоподготовки как жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) [3], твердофазная экстракция (ТФЭ) [4], а так же дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция (ДЖЖМЭ) [5] либо технология QuEChERS-экстракции [2] способствуют повышению хроматографической лабильности детектируемых соединений, пределы обнаружения которых в биообъектах методом ХМС составляют от 0.5 - 2.5 нг/см3.

СК успешно выявляются в биопробах человека методом ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией (ЭРИ). Проведенными исследованиями установлено, что основной метаболизм СК происходит под действием гепатоцитов печени. Обладающие высокой липофильностью СК могут детектироваться в условиях ВЭЖХ-МС/МС(ЭРИ) как в виде нативных соединений: AB-CHMINACA (m/z: 357, 241, 312 Да), 5F-ADВ (m/z: 378, 318, 233 Да), 5F-PB-22(m/z: 377, 232, 144), JWH-018 (m/z: 342, 155, 127), так их метаболитов, имеющих высокий уровень конъюгации. Например, в случае отсутствия в биопробах человека AB-CHMINACA регистрируют его основной метаболит – N-[[1-(циклогексилметил)-1H-индазол-3-ил)карбонил]-l-валин (основными ионами масс-спектра положительной ЭРИ являются ионы с m/z: 358, 241, 145), содержание которого в диапазоне от 5.0 до 50.0 нг/см3 служит маркером незаконного употребления AB-CHMINACA.

Одним из распространенных и перспективных подходов для исследования метаболизма новых соединений в настоящее время является использование систем in vitro с применением первичных культур клеток. Применение таких подходов позволяет не только выявлять возможные метаболические пути для конкретного соединения, но и синтезировать метаболиты, которые можно в дальнейшем использовать в структурных исследованиях и при количественных определениях в химико-аналитическом контроле. Так исследование и имплементация в ХМС методики определения метаболитов метандиенона, оксандролона и станозолола привели к возможности осуществления контроля за содержанием этих эмерджентных анаболиков в продукции животноводства. Например, методом ВЭЖХ-МС высокого разрешения с применением масс-спектрометра, оснащенного орбитальной ионной ловушкой и химической ионизацией при атмосферном давлении достаточно успешно выявляются маркеры оксандролона: 17-эпиоксандролон, 16β-гидроксиоксандролон, 7β-гидроксиметил-17α-метил-18-нор-2-окса-5α-андростан-13-ен-3-он (m/z диагностических ионов [M+H]+ и [M+H2O]+ равны 307.2268 и 289.2162 Да соответственно). C использованием предложенного в работе [6] способа определения и точности измерения отношения массы к заряду, не превышающей 2 ppm, предел обнаружения метаболитов оксандролона в биообъектах составил 0.002 - 0.005 нг/см3.

Многие из экзогенных стероидов, нашедших применение в качестве допинговых препаратов в спорте, обладающие высокой гепатотоксичностью и имеющие кросс-реакции, кроме андрогенного рецептора (АР) и с другими стероидными рецепторами, в настоящее время вытесняются селективными модуляторами андрогенных рецепторов (СМАР), являющимися синтетическими аналогами андрогенов. Они обладают по отношению к определенным типам тканей АР высокой степенью избирательности. В настоящее время ни один из СМАР не прошел полный цикл клинических исследований и не продается официально. Однако наиболее близкие к тестостерону по анаболическому действию такие производные арилпропионамида как S-4 (андарин) и S-22 (остарин), широко распространены на нелегальном рынке спортивных пищевых добавок. Разработанные методики с применением ВЭЖХ-МС/МС(ЭРИ) позволяют надежно детектировать ряд СМАР. Например, масс-хроматограмма андарина, зарегистрированная в условиях ВЭЖХ-МС/МС в режиме отрицательной ЭРИ содержит набор ионов с m/z: 289, 261, 205 и 150, образующихся из иона-предшественника [M–H] с m/z 440. Кроме андарина в моче было зафиксировано более двадцати его метаболитов из которых метаболиты андарина, образующиеся в результате глюкуронидации (m/z: 616, 440, 421, 410, 261) и моногидроксилирования (m/z: 632, 456, 261), фиксировались достаточно надежно [7]. При этом для пробоподготовки при определении СМАР в моче человека применяют ферментативный гидролиз в сочетании с ЖЖЭ или ТФЭ для извлечения аналитов из мочи после ферментативного гидролиза [8, 9]. Предел обнаружения находится в диапазоне от 0.5 до 1.0 нг/см3.

Микотоксины – низкомолекулярные вторичные метаболиты микроскопических плесневых грибов, продуцируемые чаще всего несовершенными грибами (формальный класс Fungi imperfecti) родов Fusarium, Aspergillus, Myrothecium, Stachybotrys, Trichoderma, Trichothecium, Penicillium и др., вызывают острые и хронические формы микотоксикозов. Обнаружение и количественное определение маркеров микотоксинов, присутствующих в следовых концентрациях, на фоне большого числа различных органических соединений в сложных биологических матрицах, к которым относятся биожидкости, возможно благодаря применению ВЭЖХ-МС/МС [10,11] и ее различных вариантов [12].

Наиболее интересными с практической точки зрения и применения в скрининговом ХМС анализе, характеризующимся высокой чувствительностью определения, являются следующие маркерные вещества микотоксинов:

  • 3-ацетилдезоксиниваленол, 15-ацетилдеоксиниваленол (m/z: 339, 291, 231), являющиеся признаками поражения организма дезоксиниваленолом (m/z: 297, 249, 203);
  • НТ-2 токсин (m/z: 442, 263, 105) – наиболее важный биомаркер Т-2 токсина (m/z: 484, 215, 185);
  • фумонизин (m/z: 722, 334, 704), приводящий к развитию гепатотоксичности, нефротоксичности, гепатоканцерогенности и цитотоксичности у животных и человека, а также его гидролизованная форма, образуемая в клетках печени и почек;
  • каскад метаболитов зеараленона (α- и b-зеараленол, α- и b-зеараланол, зеараланон и др.);
  • наиболее распространенные маркеры афлатоксина В1 (m/z: 313, 213, 241) самого мощного природного канцерогена для млекопитающих, являющегося этиологическим фактором возникновения гепатоцеллюлярной карциномы, к которым следует отнести его метаболиты: афлатоксикол (m/z: 297, 269, 225), афлатоксин В2, афлатоксин М1 и др.

Использование математического аппарата при поиске и идентификации масс-спектров, прогресс в области вычислительной мощности «настольных» компьютеров и широкое применение искусственного интеллекта для обработки и интерпретации данных в последнее десятилетие привели к созданию и внедрению не только автоматизированных поисковых систем, но и in silico (по аналогии с in vivo и in vitro) моделирований экспериментов, направленных на поиск возможных направлений метаболизма ксенобиотиков, предсказанию возможных сайтов молекулы, подверженных метаболизму.

Таким образом, применение методологии сопоставительного анализа показывает перспективность применения метода хромато-масс-спектрометрии для определения маркеров токсичных ксенобиотиков в биологических объектах. имеющее большое значение для практического осуществления биоаналитического контроля их содержания, а также прогнозирования и предупреждения негативных последствий их влияния на живой организм.

Текст статьи
  1. Насыбуллина Ж.Р., Фицев И.М., Шлямина О.В., Стойков И.И., Никитин Е.Н. Современные инновационные направления развития научной организации: от лабораторных исследований до внедрения в АПК // Аграрная наука в условиях модернизации и инновационного развития АПК России. Сб. материалов Всеросс. научно-практич. конф. с междунар. участием. – Иваново.: ИГСА им. Акад. Д.К. Беляева, 2020. – С. 319-323.
  2. Фицев И.М., Шлямина О.В., Сайфутдинов А.М., Макаева А.Р. Пробоподготовка способом QECHERS при определении пестицидов методом хромато-масс-спектрометрии // Фундаментальные научные исследования как фактор обеспечения конкурентоспособности общества и государства. Сб. научн. трудов Междунар. научно-практич. конф. с участием. –Белгород.: ООО АПНИ, 2020. – С. 6-323.
  3. Петров Б.И. Жидкость-жидкостная экстракция: вчера, сегодня, завтра // Известия Алтайского государственного университета. Химические науки. 2010. №3-1 (67). С.184-191.
  4. Твердофазная экстракция (ТФЭ). Обзор. URL: http://www.prochrom.ru/ru/?idp=SPE (дата обращения: 10.02.2022).
  5. Hadjmohammadi M. R., Ghoreishi S.S. Determination of Estrogens in Water Samples Using Dispersive Liquid Liquid Microextraction and High Performance Liquid Chromatography // Acta Chimica Slovenica. 2011. Vol. 58. № 4. P. 765-771.
  6. Вирюс Э.Д., Соболевский T.Г., Родченков Г.М. Обнаружение оксандролона и его метаболита в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии высокого разрешения с орбитальной ловушкой с химической ионизацией при атмосферном давлении после прекращения его приема // Журнал аналитической химии. 2009. Т. 64. № 1. С. 31-35.
  7. Дикунец М.А., Прасолов И.А., Суханова И.И., Соболевский Т.Г, Родченков Г.М. Изучение метаболизма новых допинговых препаратов методом in vitro для их последующего определения в биожидкости человека Часть I. Селективные модуляторы андрогенных рецепторов // Аналитика. 2012. №5 (6). С. 6-15.
  8. Krug O., Thomas A., Beuck S., Schenk I., Machnik M., Schänzer W., Bondesson U., Hedeland M., Thevis M. Characterization of in vitro synthesized equine metabolites of the selective androgen receptor modulators S24 and S4 // J. Equine Vet. Sci. 2012. V. 32. № 9. P. 562-568.
  9. Темердашев А.З., Дмитриева Е.В. Методы определения селективных модуляторов андрогенных рецепторов // Журнал аналитической химии. 2020. Т. 75. № 7. С. 579-596.
  10. Brezina U., Valenta H., Rempe I., Kersten S., Humpf H., Dänicke S. Development of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of zearalenone, deoxynivalenol and their metabolites in pig serum // Mycotoxin Res. - 2014. - Vol. 30. - №3. - P.171-186.
  11. Escrivá L., Font G., Manyes L., Berrada H. Studies on the Presence of Mycotoxins in Biological Samples: An Overview // Toxins. - 2017. - Vol. 9. - №8.- Р. 251.
  12. Рахметова Э.Р., Мухарлямова А.З., Сайфутдинов А.М., Фицев И.М., Гармонов С.Ю. Возможности определения микотоксинов при использовании способа фотоионизации в ВЭЖХ-МС анализе // Вестник технологического университета. 2021. Т. 24. № 4. С. 14-17.
Список литературы
Ведется прием статей
Прием материалов
c 01 октября по 07 октября
Осталось 5 дней до окончания
Публикация электронной версии статьи происходит сразу после оплаты
Справка о публикации
сразу после оплаты
Размещение электронной версии журнала
11 октября
Загрузка в eLibrary
11 октября
Рассылка печатных экземпляров
21 октября