Хромато-масс-спектрометрическое определение маркеров токсичных ксенобиотиков в биологических объектах

Модернизация научных процессов способствует росту и развитию инновационного потенциала научных организаций, проектированию новых научных знаний. В этой связи сопоставительный анализ представляется эффективным средством изучения и адаптации наилучших методов достижения высоких научных показателей, создания эталона оценки для совершенствования собственных результатов [1].

Цель настоящей работы состоит в применении методологии сопоставительного анализа для оценки перспектив применения метода хромато-масс-спектрометрии (ХМС) при определении токсичных ксенобиотиков и их маркеров в биологических объектах.

Контроль содержания в биологических объектах ксенобиотиков и продуктов их биотрансформации (маркеров), представляющих реальную угрозу безопасности жизни и здоровью человека является в настоящее время актуальной проблемой. К ним относятся: природные и синтетические психоактивные и ядовитые вещества, малоизученные новейшие лекарственные препараты, продукты биотрансформации органических поллютантов различных классов, вторичные метаболиты продуктов жизнедеятельности плесневых грибов (микотоксины) и др. Актуальность выявления маркеров токсичных ксенобиотиков в биологических объектах обусловлена:

• необходимостью раннего предупреждения возникновения новых потенциальных угроз безопасности жизнедеятельности;
• заблаговременной биомедицинской диагностикой их негативного воздействия и предотвращения необратимых последствий на живой организм, результатом которых являются токсикозы не выявленной этиологии с летальным исходом;
• разработкой и принятием необходимых нормативных правовых актов, направленных на минимизацию угроз, в том числе их бесконтрольного применения либо распространения.

Широкое применение для решения этих задач в настоящее время находят методы хроматографического разделения в сочетании с масс-спектрометрическим (МС) детектированием, основанные на принципах газовой хроматографии (ГХ-МС) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ-МС), в том числе с использованием ее тандемного варианта (ВЭЖХ-МС/МС) [2]. При этом объектами химико-аналитического и биомедицинского контроля являются:

• биологические жидкости человека (кровь, моча, слюна, пот, меконий), волосы, срезы свободных частей ногтевых пластин пальцев рук, органы и ткани;
• биологические жидкости животных (кровь, моча, молоко), органы и ткани.

При этом основные направления прикладного применения ХМС направлены на выявление в биологических объектах:

• веществ и препаратов (в том числе психоактивных), их аналогов и прекурсоров, находящиеся под специальным международным и национальным контролем;
• ядовитых и сильнодействующих веществ, включенных в международные и национальные списки соответствующих конвенций;
• стойких органических поллютантов, а также микробных маркеров.

Сопоставительный анализ высокочувствительного ХМС определения популяционных веществ-маркеров, аналитические характеристики методик определения и используемые для этого способы пробоподготовки рассмотрены ниже на примере веществ, представляющих интерес с точи зрения их токсикологических параметров и значения их биомедицинского контроля в биологических объектах.

С развитием ХМС скрининга для предупреждения роста злоупотреблений психоактивными веществами, например, содержащими фитоканнабиноиды (ФК) либо синтетические каннабимиметики (СК) – агонисты каннабиноидных рецептов, были получены результаты изучения влияния химической структуры этих соединений и продуктов их биотрансформации на их токсикологические свойства. Было установлено, что основными мишенями ФК - D9-тетрагид-роканнабинола (D9-ТГК) и СК различных классов (циклогексилфенолы, нафтоилиндолы, фенилацетилиндолы, бензоилиндолы, индол- и индазол-3-карбоксамиды, индол-3-карбоксилаты и др.) в организме являются каннабиноидные рецепторы CB₁ (К_i=10 нМ), располагающиеся, главным образом, в клетках ЦНС и CB₂, экспрессирующие в клетках иммунной системы. Психоактивный эффект ФК и СК связан с активацией CB₁- и CB₂-рецепторов, что ведёт к ингибированию аденилатциклазы и уменьшению концентрации вторичного мессенджера циклического аденозилмонофосфата.

При ГХ-МС исследовании биологических объектов от лиц, употреблявших Cannabis, было установлено, что в организме человека D9-ТГК быстро метаболирует до двух основных соединений: 11-нор-9-карбокси-D-9-тетрагидроканнабинола (11-СООН-TГК, основные целевые ионы масс-спектра, m/z(Да): 413, 515, 572) и 11-гидрокси-D-9-тетрагидроканнабинола (11-ОН-TГК, m/z: 371, 474, 459), являющихся маркерами употребления ФК. Проведение реакций метилирования, силилирования и ацетилирования с применением различных дериватизирующих агентов и таких способов пробоподготовки как жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) [3], твердофазная экстракция (ТФЭ) [4], а так же дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция (ДЖЖМЭ) [5] либо технология QuEChERS-экстракции [2] способствуют повышению хроматографической лабильности детектируемых соединений, пределы обнаружения которых в биообъектах методом ХМС составляют от 0.5 - 2.5 нг/см³.

СК успешно выявляются в биопробах человека методом ВЭЖХ-МС/МС с электрораспылительной ионизацией (ЭРИ). Проведенными исследованиями установлено, что основной метаболизм СК происходит под действием гепатоцитов печени. Обладающие высокой липофильностью СК могут детектироваться в условиях ВЭЖХ-МС/МС(ЭРИ) как в виде нативных соединений: AB-CHMINACA (m/z: 357, 241, 312 Да), 5F-ADВ (m/z: 378, 318, 233 Да), 5F-PB-22(m/z: 377, 232, 144), JWH-018 (m/z: 342, 155, 127), так их метаболитов, имеющих высокий уровень конъюгации. Например, в случае отсутствия в биопробах человека AB-CHMINACA регистрируют его основной метаболит – N-[[1-(циклогексилметил)-1H-индазол-3-ил)карбонил]-l-валин (основными ионами масс-спектра положительной ЭРИ являются ионы с m/z: 358, 241, 145), содержание которого в диапазоне от 5.0 до 50.0 нг/см³ служит маркером незаконного употребления AB-CHMINACA.

Одним из распространенных и перспективных подходов для исследования метаболизма новых соединений в настоящее время является использование систем in vitro с применением первичных культур клеток. Применение таких подходов позволяет не только выявлять возможные метаболические пути для конкретного соединения, но и синтезировать метаболиты, которые можно в дальнейшем использовать в структурных исследованиях и при количественных определениях в химико-аналитическом контроле. Так исследование и имплементация в ХМС методики определения метаболитов метандиенона, оксандролона и станозолола привели к возможности осуществления контроля за содержанием этих эмерджентных анаболиков в продукции животноводства. Например, методом ВЭЖХ-МС высокого разрешения с применением масс-спектрометра, оснащенного орбитальной ионной ловушкой и химической ионизацией при атмосферном давлении достаточно успешно выявляются маркеры оксандролона: 17-эпиоксандролон, 16β-гидроксиоксандролон, 7β-гидроксиметил-17α-метил-18-нор-2-окса-5α-андростан-13-ен-3-он (m/z диагностических ионов [M+H]⁺ и [M+H₂O]⁺ равны 307.2268 и 289.2162 Да соответственно). C использованием предложенного в работе [6] способа определения и точности измерения отношения массы к заряду, не превышающей 2 ppm, предел обнаружения метаболитов оксандролона в биообъектах составил 0.002 - 0.005 нг/см³.

Многие из экзогенных стероидов, нашедших применение в качестве допинговых препаратов в спорте, обладающие высокой гепатотоксичностью и имеющие кросс-реакции, кроме андрогенного рецептора (АР) и с другими стероидными рецепторами, в настоящее время вытесняются селективными модуляторами андрогенных рецепторов (СМАР), являющимися синтетическими аналогами андрогенов. Они обладают по отношению к определенным типам тканей АР высокой степенью избирательности. В настоящее время ни один из СМАР не прошел полный цикл клинических исследований и не продается официально. Однако наиболее близкие к тестостерону по анаболическому действию такие производные арилпропионамида как S-4 (андарин) и S-22 (остарин), широко распространены на нелегальном рынке спортивных пищевых добавок. Разработанные методики с применением ВЭЖХ-МС/МС(ЭРИ) позволяют надежно детектировать ряд СМАР. Например, масс-хроматограмма андарина, зарегистрированная в условиях ВЭЖХ-МС/МС в режиме отрицательной ЭРИ содержит набор ионов с m/z: 289, 261, 205 и 150, образующихся из иона-предшественника [M–H]^– с m/z 440. Кроме андарина в моче было зафиксировано более двадцати его метаболитов из которых метаболиты андарина, образующиеся в результате глюкуронидации (m/z: 616, 440, 421, 410, 261) и моногидроксилирования (m/z: 632, 456, 261), фиксировались достаточно надежно [7]. При этом для пробоподготовки при определении СМАР в моче человека применяют ферментативный гидролиз в сочетании с ЖЖЭ или ТФЭ для извлечения аналитов из мочи после ферментативного гидролиза [8, 9]. Предел обнаружения находится в диапазоне от 0.5 до 1.0 нг/см³.

Микотоксины – низкомолекулярные вторичные метаболиты микроскопических плесневых грибов, продуцируемые чаще всего несовершенными грибами (формальный класс Fungi imperfecti) родов Fusarium, Aspergillus, Myrothecium, Stachybotrys, Trichoderma, Trichothecium, Penicillium и др., вызывают острые и хронические формы микотоксикозов. Обнаружение и количественное определение маркеров микотоксинов, присутствующих в следовых концентрациях, на фоне большого числа различных органических соединений в сложных биологических матрицах, к которым относятся биожидкости, возможно благодаря применению ВЭЖХ-МС/МС [10,11] и ее различных вариантов [12].

Наиболее интересными с практической точки зрения и применения в скрининговом ХМС анализе, характеризующимся высокой чувствительностью определения, являются следующие маркерные вещества микотоксинов:

• 3-ацетилдезоксиниваленол, 15-ацетилдеоксиниваленол (m/z: 339, 291, 231), являющиеся признаками поражения организма дезоксиниваленолом (m/z: 297, 249, 203);
• НТ-2 токсин (m/z: 442, 263, 105) – наиболее важный биомаркер Т-2 токсина (m/z: 484, 215, 185);
• фумонизин (m/z: 722, 334, 704), приводящий к развитию гепатотоксичности, нефротоксичности, гепатоканцерогенности и цитотоксичности у животных и человека, а также его гидролизованная форма, образуемая в клетках печени и почек;
• каскад метаболитов зеараленона (α- и b-зеараленол, α- и b-зеараланол, зеараланон и др.);
• наиболее распространенные маркеры афлатоксина В1 (m/z: 313, 213, 241) самого мощного природного канцерогена для млекопитающих, являющегося этиологическим фактором возникновения гепатоцеллюлярной карциномы, к которым следует отнести его метаболиты: афлатоксикол (m/z: 297, 269, 225), афлатоксин В₂, афлатоксин М₁ и др.

Использование математического аппарата при поиске и идентификации масс-спектров, прогресс в области вычислительной мощности «настольных» компьютеров и широкое применение искусственного интеллекта для обработки и интерпретации данных в последнее десятилетие привели к созданию и внедрению не только автоматизированных поисковых систем, но и in silico (по аналогии с in vivo и in vitro) моделирований экспериментов, направленных на поиск возможных направлений метаболизма ксенобиотиков, предсказанию возможных сайтов молекулы, подверженных метаболизму.

Таким образом, применение методологии сопоставительного анализа показывает перспективность применения метода хромато-масс-спектрометрии для определения маркеров токсичных ксенобиотиков в биологических объектах. имеющее большое значение для практического осуществления биоаналитического контроля их содержания, а также прогнозирования и предупреждения негативных последствий их влияния на живой организм.