научный журнал «Актуальные исследования» #7 (86), февраль '22

Лазерные технологии в вирусологии: монохромный анализ наночастиц в диагностике ВПЧ-индуцированных заболеваний по слюне

В современной медицине одной из актуальных задач является проблема ранней неинвазивной диагностики заболеваний онкологической и предраковой природы, причиной которых является вирус папилломы человека, которые характеризуются латентным хроническим течением, что затрудняет их раннюю диагностику общепринятыми методами исследования. Целью работы явилась оценка возможностей применения монохромного анализа наночастиц в лабораторной диагностике вируса папилломы человека и ВПЧ-индуцированных заболеваний неинвазивным методом по слюне. Поставленная цель решалась выполнением задач, а именно: разработкой диагностического алгоритма монохромного анализа наночастиц для определения референтных значений спектральных характеристик слюны больных ВПЧ-индуцированными предраковыми заболеваниями и раком шейки матки (основная группа), общесоматическими заболеваниями той же локализации (группа сравнения) и практически здоровых лиц (контрольная группа); вычислением показателей диагностической эффективности тестирования (чувствительность, специфичность, эффективность, предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов). Материалы и методы: методом монохромного анализа наночастиц был исследован биоматериал (слюна) 195 пациентов в возрастном диапазоне от 20 до 69 лет, находившихся в Центре восточной и европейской медицины (г. Москва) на восстановительном лечении в период со середины 2020 по сентябрь 2021 года. Результаты и обсуждение: было установлено, что наиболее типичные спектры слюны больных с диагнозом ВПЧ-индуцированного рака и предрака шейки матки являлись многомодальными с наибольшим вкладом в светорассеяние, создаваемыми наночастицами малого гидродинамического диаметра. Анализ результатов исследования показал наличие статистически достоверных (р<0,001) сдвигов в системе гомеостаза у данных больных. Показатель диагностической специфичности метода МАН, вычисленный по группе практически здоровых лиц, составил 92%, диагностическая чувствительность метода в отношении рака шейки матки составила 91%. Выводы: внедрение методики в практическое здравоохранение позволит проводить скрининг ВПЧ-индуцированных заболеваний и формировать группы повышенного онкологического риска для повышения эффективности их диагностики и лечения.

Аннотация статьи
вирус папилломы человека
лазерная спектроскопия
слюна
скрининг
рак шейки матки
Ключевые слова

Введение

В современной вирусологии одной из актуальных задач является проблема ранней неинвазивной диагностики заболеваний, причиной которых является вирус папилломы человека (ВПЧ), приводящий к более чем 300-тысячной ежегодной смертности мирового населения [1]. Болезни, индуцированные ВПЧ, характеризуются бессимптомной начальной фазой (что затрудняет раннюю диагностику) и осложнениями, связанными с ВПЧ индуцированным канцерогенезом [2]. Персистируя в организме носителя неограниченно долго и не проникая в кровь, ВПЧ поражает базальные клетки слизистых оболочек урогенитального тракта, обеспечивая перманентное инфицирование клеток эпителия [3].

ВПЧ относится к ДНК-содержащей разновидности папилломавирусов, насчитывающих более 200 штаммов, которые в зависимости от канцерогенных способностей подразделяются на вирусы высокого онкогенного потенциала (типы 16, 18 и другие) и низкого (типы 6, 11 и другие) риска развития злокачественных опухолей [4].

Подавляющее большинство случаев развития рака шейки матки и других смежных анатомо-физиологических областей провоцируется ВПЧ 16 и 18 типов [5]. ВПЧ 6 и 11 типов являются причиной появления аногенитальных бородавок и респираторного папилломатоза [6].

Инкубационный период ВПЧ от нескольких месяцев до нескольких лет [7]. Инфицирование человека может происходить как одним, так и несколькими типами ВПЧ [8]. Первичное и вторичное ослабление иммунитета, гормональная терапия, авитаминоз, стресс, вредные привычки являются состояниями, способствующими инфицированию человека вирусом ВПЧ и дальнейшему развитию заболевания и его осложнений [9].

Рандомизированными клиническими исследованиями показана корреляция между ВПЧ и раком шейки матки (РШМ), заднего прохода и в некоторых случаях рака ротовой полости и гортани, среди которых РШМ является одним из самых распространенных злокачественных новообразований у женщин (более 550 тысяч новых случаев в год и свыше 300 тысяч летальных исходов) [10]. По статистическим расчётам ВПЧ повышает риск развития онкологического заболевания в организме его носителя более чем в несколько сотен раз, протекая в организме преимущественно латентно, сопровождаясь клинической симптоматикой лишь при развитии рака [11].

В связи с этим, одной из основных задач выявления ВПЧ, сопряженного с высоким риском канцерогенных эффектов, является ранняя диагностика индуцированных им предраковых изменений [12]. Для этого в арсенале диагностических методов имеются цитологическое, кольпоскопическое и гистологическое исследования, а также лабораторные молекулярно-биологические тесты, позволяющие детектировать наличие инфекции в организме и выполнять генотипирование ВПЧ [13]. Цитологическим анализом мазка верифицируются изменения морфологической структуры клеток, позволяющий выявлять случаи легкой дисплазии [14]. Одними из недостатков данного метода является субъективная трактовка его результатов, зависящая от квалифицированности специалиста-цитолога, и низкие показатели чувствительности в отношении тяжелой дисплазии и рака, колеблющиеся в диапазоне от 18 до 85 процентов [15]. Диагностическая чувствительность кольпоскопического метода по литературным данным составляет 70-80 процентов, требуя при этом оснащённого специализированного кабинета с оборудованием и подготовленным персоналом [16]. Гистологическое исследование предоставляет возможность верифицировать диагноз, но не может играть роль скринингового метода исследования в силу его трудоёмкости [17]. Лабораторные методы выявления ВПЧ, включая ПЦР-диагностику, отвечают на вопрос наличия или отсутствия инфекции в организме обследуемого, но не позволяют дать ответы относительно степени и стадии инфекционного процесса, применяясь в итоге в комплексном обследовании наряду с другими методами исследований [18]. Серологические методы диагностики ВПЧ основаны на методике выявления антител против специфичных белков Е2, Е6 и Е7, которые являются его маркером, и гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими зондами с последующим выделением вируса с помощью моноклональных антител к его ДНК [19]. По данным некоторых исследователей сочетанное применение лабораторных и цитологических методов выявления вируса папилломы человека способно повысить показатели диагностической чувствительности в отношении рак/предрак шейки матки до 95% [20].

В настоящее время в проблеме раннего выявления ВПЧ общепризнанной является «Стратегия скрининга и наблюдения», основанная на проведение широкомасштабного скринингового обследования женщин с целью формирования ограниченного количества лиц, составляющих по результатам тестирования группу повышенного онкологического риска (ГПОР) в отношении РШМ, внутри которой проводится уточняющая диагностика с использованием гистологических, цитологических и лабораторных методов исследования [21].

Степень онкогенности различных генотипов ВПЧ не одинакова. Наибольшей опухолеиндуцирующей способностью обладают 16 и 18 типы вируса папилломы человека, имеющие диаметр вирусных частиц 53-55 нм, состоящих из 72 капсомеров и лишённых внешней оболочки [22].

В связи с высокой социальной значимостью ВПЧ и ВПЧ-индуцированных заболеваний актуальной становится проблема разработки методологии неинвазивного скрининга населения, которая позволила бы прямым методом обнаруживать вирус в биологических жидкостях человека, формировать по результатам исследования ГПОР, а также диагностировать ВПЧ-ассоциированные предраковые состояния и злокачественные новообразования.

Метод монохромного анализа наночастиц (МАН) является усовершенствованной модификацией метода лазерно-корреляционной спектроскопии (ЛКС) [23], что обусловливает их широкое применение в приборах различных фирм для медицинских и биологических исследований [24]. По сравнению с другими методами медико-биологических исследований, метод МАН обладает рядом существенных преимуществ: широким диапазоном исследуемых фракций, возможностью одновременного анализа частиц разных гидродинамиических диаметров (структурно-функциональный анализ молекулярных ингредиентов биологических жидкостей), учётом характера межмолекулярных взаимодействий отдельных ингредиентов, достаточностью минимального количества исследуемого биоматериала, простой процедурой подготовки образцов к анализу, высокой скоростью измерений изучаемого образца и получения качественной и количественной информации [25]. [Лазерная спектроскопия, в целом, и МАН, в частности, основаны на методологии динамического светорассеяния (ДС). Для измерения таких спектров применяются методы оптического смешения на основе гетеродинирования и исследования самобиений частот рассеянного света [26].

Метод гетеродинирования заключается в смешении опорного лазерного излучения и излучения, рассеянного на исследуемом образце, на чувствительном элементе фотоприемника [27]. В этом случае фототок пропорционален квадрату суммы поля опорного излучения и поля рассеянного излучения [28]. Сущность метода самобиений состоит в том, что свет, рассеянный исследуемым участком образца, направляется на фотоприемник, на котором и возникают биения между различными частотными компонентами спектра падающего света [29]. При этом ток фотоприемника оказывается промодулированым по амплитуде частотами биений флуктуаций концентраций частиц под воздействием света, рассеянного на исследуемом образце от нуля до ширины спектра рассеяния [30]. Релаксация микроскопических флуктуаций концентрации частиц к равновесному состоянию описывается уравнением диффузии:

     (1)

где Np – концентрация частиц, Δ – оператор Лапласа и D – коэффициент диффузии, который является ключевым параметром для определения размеров исследуемых частиц.

Решением уравнения диффузии в одномерном случае является экспоненциальная функция с показателем степени, содержащим коэффициент диффузии частиц D. В случае рассеяния света на флуктуациях концентрации монодисперсных частиц, решением является корреляционная функция поля g(1)(τ):

     (2)

где τ – время релаксации флуктуаций концентрации частиц, которое обратно пропорционально характерной ширине Г спектра мощности света.

Спектр мощности рассеянного света в случае, когда частицы в растворе одного размера, представляет собой Лоренциан, максимум которого, расположен на частоте возбуждающего света. Ширина Лоренциана на полувысоте равна:

    (3)

где D – коэффициент диффузии частиц, q – волновой вектор рассеяния света.

Метод ДС позволяет определять размеры частиц в моно- и полидисперсных растворах. При исследовании полидисперсных растворов, каковыми являются практически все биологические жидкости, крайне важно, кроме определения размеров белков, агрегатов и везикулярных частиц не нарушать их целостность и концентрацию и, для этого, необходимо проводить измерения в их естественной среде.

Обработка рассеянного света базируется на следующем алгоритме.

Спектр мощности рассеянного света, падающего на фотоприемник, представляет собой Лоренциан, и в случае непрерывных распределений частиц по размерам имеет следующий вид:

    (4)

где А(Г) – функция распределения интенсивности рассеяния частиц по характерным для них диффузионным уширениям.

Наибольший интерес представляет вариационный метод, так как именно он используется в работе для обработки результатов [31].

Биологические жидкости находятся в тонком равновесии, определяемом ионной силой раствора, значением рН и рядом других факторов [32]. Это обстоятельство исключает возможность изучения распределения размеров белков, липопротеинов и агломератов объектов в биологических жидкостях всеми классическими методами (в том числе методами проточной цитометрии), так как эти методы требуют препарирования образцов, приводящего к изменению условий существования, входящих в них агломератов [33]. Этого недостатка лишен метод МАН, который может применяться к исходному образцу нативной биологической жидкости. Метод МАН способен также обнаруживать незначительные изменения исследуемого объекта при сравнении спектров света, рассеянного образцом до и после изменения условий. Информация об исследуемом объекте методом МАН максимально достоверна т.к. в процессе измерений состояние образца не меняется под действием внешних факторов (лазерного излучения, температуры, химических реагентов и т.д.).

При патологических процессах, происходящих в организме человека, в крови увеличивается количество циркулирующих нанокомплексов, в первую очередь, внеклеточных везикул, а их вид и состав различны в зависимости от вида патологии [34]. Впоследствии эти везикулы поступают во все органы и ткани организма. За работы по изучению везикулярного обмена информацией в организме в 2013 году была присуждена Нобелевская премия: «Нобелевская премия по физиологии и медицине (2013): везикулярный транспорт» [35].

Широко применяемые сегодня методы диагностики онкологических заболеваний, включая анализы на онкомаркеры, УЗИ и другие более дорогостоящие и сложные методы исследований, включая магниторезонансную томографию, не позволяют выявлять предраковые заболевания и ЗНО на ранней и сверхранней стадии, что, как следствие, не позволяет своевременно назначать эффективное лечение [36].

Для проведения исследований необходимо получить раствор слюны. Это требование связано с тем, что исследование неразбавленных образцов слюны не отвечает важному теоретическому аспекту метода МАН, а именно принципу «однократного рассеяния света». Выбор концентрации раствора слюны был основан на влиянии на результат измерений нескольких факторов, а именно: высокая концентрация частиц малых размеров сказывается на детектируемых размерах, связанных с взаимодействием между молекулами белка; малая концентрация крупных частиц в объеме рассеяния влияет на низкочастотную область спектра мощности и, следовательно, дополнительного пика в распределении мощности по размерам; при большой концентрации крупных частиц измерениям может мешать двукратное и многократное рассеяние; при низкой концентрации частиц в растворе уровень полезного сигнала незначительно превышает уровень шумов [37].

Для устранения возможных погрешностей при измерениях был проведен ряд тестирований НБЖ с целью определения оптимальной концентрации раствора слюны для исследований. Были получены следующие результаты: при концентрациях раствора от 1 % до 10 % в Фурье-спектрах мощности рассеянного света наблюдаются шумы, по порядку величины сопоставимые с уровнем полезного сигнала; с увеличением концентрации раствора с 1% до 20% мощность рассеянного света линейно возрастает; при концентрации свыше 20% мощность рассеянного света выходит на постоянный уровень. Такая зависимость может быть связана с процессом многократного рассеяния света исследуемым объектом. Исходя из полученных данных выбран оптимальный диапазон концентраций от 10% до 20%.

Специфика исследования биологических жидкостей человека

В медицинской диагностике для установления заболевания и контроля за его течением исследуют различные биологические жидкости организма: кровь, слюну, ликвор, мочу. Все эти жидкости имеют сложный белковый состав. Наибольший интерес имеет исследование слюны в виде ротоглоточных смывов по причине неинвазивности забора биоматериала у пациента.

Пациенту предлагают 30 мл физиологического раствора, в разовом стакане и просят тщательно (в течение 0,5-1 мин.) прополоскать полость рта и глотки и сплюнуть жидкость обратно в стакан. Из полученной взвеси микропипеткой объемом 1000 мкл отбирают 1 мл в стерильную одноразовую пробирку, закупоривают и центрифугируют в при 2500 об/мин в течение 5 мин. 0,8 мл надосадочной жидкости осторожно (чтобы не задеть осадок) переносят в кювету спектроскопа для исследования. Суть предлагаемого метода заключается в анализе рассеянного света, получаемого путем просвечивания лазером биологической жидкости человека. Лазерный луч фокусируется на образце. Белки, находящиеся в жидкости, рассеивают свет, который фиксируется детектором. По характеру изменения интенсивности рассеянного света во времени можно определить, какого размера наночастицы находятся в жидкости. Размеры детектируемых молекул зависит от наличия в организме исследуемого тех или иных заболеваний. Учитывая успешность применения метода ЛКС [38], в последние годы появилась возможность усовершенствования приборной базы и программного обеспечения, что легло в основу монохромного анализатора наночастиц (МАН).

Цель настоящей работы: оценка возможностей применения лазерной технологии сканирования нативной биологической жидкости (в виде монохромного анализа наночастиц) в лабораторной скрининговой диагностике вируса папилломы человека и ВПЧ-индуцированных заболеваний неинвазивным методом по слюне. Поставленная цель решается выполнением ряда задач:

  • разработка диагностического алгоритма монохромного анализа наночастиц для определения референтных значений спектральных характеристик слюны больных ВПЧ-индуцированными предраковыми заболеваниями и раком шейки матки (основная группа), общесоматическими заболеваниями той же локализации (группа сравнения) и практически здоровых лиц (контрольная группа);
  • определение показателей степени дифференцированности спектров слюны практически здоровых лиц от гистограмм слюны больных раком шейки матки, предраковой патологии и общесоматических заболеваний той же локализации при попарном сравнении;
  • вычисление показателей диагностической эффективности тестирования (чувствительность, специфичность, эффективность, предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов).

Материалы и методы

Состав установки МАН: спектрометр лазерный с длиной волны 633 нм; персональный компьютер с эксклюзивным программным обеспечением для приёма сигнала с аналого-цифрового преобразователя и последующей обработки результатов исследования; лабораторная посуда для подготовки образцов к исследованию [39].

Спектрометр МАН состоит из следующих узлов: оптический блок; кювета для исследования биологической жидкости; гелий-неоновый лазер (длина волны - 633 нм); фотоприёмник; аналого-цифровой преобразователь (АЦП); блок питания.

Оптический блок спектрометра состоит из оптических элементов, фокусирующих лазерный на кювете с исследуемым образцом биологической жидкости и собирающих рассеянный свет от кюветы с находящейся в ней исследуемой НБЖ на фотоприемное устройство [40]. Оптический блок спектрометра выполняет фиксацию положения лазера, фотоприемного устройства и элементов формирующей оптики. Лазерный модуль состоит из гелий-неонового лазера и блока его питания. Фотоприемное устройство (ФПУ) предназначено для регистрации рассеянного света от частиц исследуемого образца, преобразования его в электрический сигнал и усиления его для подачи на АЦП. Фотоприёмник обеспечивает высокую чувствительность преобразования падающего света лазера в электрический ток. АЦП представляет собой 14-разрядный преобразователь входного напряжения в диапазоне от 0 до 3 вольт в полосе частот от 0 до 10 МГц. Подача оцифрованного сигнала на компьютер осуществляется через USB-порт. Блок питания спектрометра предназначен для получения стабильного напряжения, необходимого для питания электронных устройств прибора из напряжения 220 В с частотой 50 Гц.

Принципиальная оптическая схема спектрометра МАН приведена на рис. 1.

Рис. 1. Блок-схема монохроматического анализатора наночастиц,
где 1 – лазер; 2 – кювета; 3, 4 – фотоприемные устройства; 5 – поворотный блок; 6, 7 – поляризаторы; 8 – электронный блок

Исходя из того, что объектом исследований являются жидкости, в т.ч. биологические, которые содержат в своём составе наночастицы белков, длина волны излучения устанавливалась исходя из спектров поглощения белков, воды, и крайних размеров белковых комплексов слюны порядка от 1 нм до 1000 нм. Выбор длины волны лазерного излучения в окне прозрачности спектра поглощения воды позволяет избежать потери мощности излучения за счет поглощения и, соответственно, возбуждения молекул воды. В связи с вышесказанным для исследования водных растворов слюны оптимальным является длина волны лазерного излучения 633 нм.

Метод МАН, используемый в настоящих исследованиях, суть которого заключается в модуляции лазерного излучения частотой броуновского колебания исследуемых частиц, подразумевает, что влияние фотонов света лазерного излучения не должно вносить значимых изменений в исследуемую систему. Таким образом, к рабочим узлам аппаратуры, одним из которых является лазерный модуль, предъявляются высокие требования.

Прибор МАН предназначен для исследования органических и неорганических наночастиц в жидкостях, в том числе биологических. По своим параметрам МАН не уступает зарубежным ЛК-спектрометрам (быстродействие составляет 1-5-10 минут в зависимости от количества накоплений), что может влиять на погрешность измерений, объем исследуемой жидкости от 0.5 мл до 5 мл, диапазон измеряемых размеров частиц от 1 нм до 10 мкм. Таким образом, результаты измерений показывают, что МАН позволяет получать достоверные результаты, а также исследовать полидисперсные растворы биологических жидкостей, такие как слюна и плазма крови. Применяемый способ позволяет оценить состояние организма путем прямого измерения распределения по размерам наноструктур в слюне человека по результатам МАН-исследования.

При исследовании параметров частиц методом МАН важно минимизировать влияние факторов на исследуемую среду, в том числе и нелинейные эффекты. Это связано с тем, что информация о размерах и процентном соотношении частиц в образце слюны связана с мощностью рассеянного ими света. Растворы наночастиц в слюне обычно малоконцентрированы и могут проявлять нелинейные свойства при взаимодействии с низкоинтенсивным лазерным излучением. В зависимости от свойств слюны и содержащихся в ней наночастиц, различных по форме и размерам нелинейность интенсивности выходного излучения в зависимости от входной интенсивности носит различный характер. Для автоматизации обработки выходных данных спектрометра МАН был использован аналого-цифровой преобразователь АЦП Е20-10, поставляемый фирмой LCard в комплекте с АЦП. Это позволило записывать сигнал с МАН в цифровом формате на жёсткий диск персонального компьютера. Для визуализации результатов исследования образцов применялась программа-классификатор, которая позволяла в автоматическом режиме анализировать спектры, выдавая информацию о гидродинамических размерах наночастиц и их вкладе в светорассеяние. Алгоритм работы программы-классификатора основан на т.н. методе «теория групп», когда индивидуальные спектры дифференцируются между собой в 32-мерном пространстве [41]. Для каждой из двух сравниваемых групп проводились границы зон, которые соответствовали дисперсиям распределений "две сигмы". Масштабы по осям отображались в логарифмическом масштабе. Результаты измерения образцов слюны методом МАН представляются в виде гистограмм, описывающих вид функции распределения частиц слюны по размерам (диаметру) и вкладу в светорассеяние, при этом высота пиков пропорциональна относительному вкладу частиц данного диаметра в суммарный спектр лазерного излучения в заданном частотном диапазоне. Весь диапазон спектра от 1 до 10000 нм условно разделялся на пять фракций (поддиапазонов) соответственно размерам детектируемых наночастиц: 1 – 10 нм; 11 – 30 нм; 31 – 70 нм; 71 – 150 нм; > 151нм. Статанализ данных проводился с вычислением показателя «среднее арифметическое» и его стандартной ошибки, а в случае попарного сравнения результатов исследования, полученных от двух и более групп, – метод «попарного множественного сравнения» [42].

Для оценки достоверности показаний МАН проводились измерения опытных образцов, которые состояли из сферических наночастиц латекса диаметром 100 нм и в виде суспензии находились в водном растворе. Их размеры, полученные после обработки данных в программе-классификаторе составляли 96-102 нм. По серии проведенных измерений относительная погрешность составила не более 4%. Результаты замеров частиц латекса с диаметром 100 нм в водной суспензии показаны в табл. 1.

Таблица 1

Результаты замеров сферических наночастиц латекса диаметром 100 нм

№ измерения

Первая серия измерений

Вторая серия измерений

Средние размеры наночастиц латекса, нм

1

102

101

2

98

100

3

96

98

Важным фактором в измерениях, проводимых методом МАН, является время экспозиции. Измерения проводились несколько раз подряд (время одного измерения составляет 10 минут), пробирка с раствором не извлекалась из кюветы и воздействие на образец лазерного излучения было постоянным.

Забор слюны у пациентов проводился строго натощак, перед взятием биоматериала проводилось предварительное полоскание полости рта в течение 10-15 секунд 25-40 мл изотонического раствора натрия хлорида. Хранение образцов осуществлялось при комнатной температуре – в течение 6 ч., при температуре от 2°С до 8°С – в течение 3 суток, при температуре минус 20°С – в течение полугода, при температуре минус 70°С – длительно.

Определение размеров наночастиц слюны проводилось следующим образом: раствор слюны в виде ротоглоточного смыва (РГС) после 10-минутного центрифугирования при 2500 об/мин микропипеткой отбирался и помещался в кювету МАН, проводилось три измерения подряд в течение 10 минут каждое, раствор постоянно находился под воздействием лазерного излучения, при комнатной температуре.

Исследования слюны в виде РГС методом МАН проводилось в «Центре европейской и восточной медицины» с 2019 по 2021 год, и были обследованы 195 пациентов. Большинство обследованных (более 98%) пациентов были женщинами в возрасте от 20 до 69 лет. Заключение о состоянии здоровья давалось на основании результатов комплексного медицинского обследования больных в медицинских учреждениях по месту жительства. По превалирующей симптоматике основного патологического процесса исследуемые были разделены на три группы: две основных: а) больные с верифицированными случаями РШМ (30 наблюдений) и б) пациенты с предраковыми заболеваниями шейки матки (45 наблюдений), группу сравнения (больные с общесоматическими заболеваниями матки преимущественно воспалительной этиологии (67 наблюдений) и контрольную группу (практически здоровые пациенты в количестве 53 человек). Всем пациентам проводилась лазерная спектроскопия слюны.

Наблюдаемые случаи РШМ включали плоскоклеточный рак следующих гистологических типов: ороговевающий (высокодифференцированный), неороговевающий (дифференцированный) и с низкой дифференцировкой (низкодифференцированный), базалоидный, кондиломатозный (бородавчатый), лимфоэпителиомоподобный, папиллярный (сосочковый), а также некоторые виды аденокарциномы шейки матки (эндофитные, экзофитные и смешанные).

Предраковые заболевания матки были представлены эрозиями, полипами, дисплазиями средней и тяжёлой степени, кондиломами шейки матки.

Общесоматические заболевания матки преимущественно воспалительного характера подразделялись на эндометрит, эндомиометрит, метроэндометрит, параметрит, периметрит и панметрит, которые объективно устанавливались и подтверждались морфологически.

Группа практически здоровые пациентов состояла из лиц, при углублённом обследовании которых не было выявлено патологии.

Осмотр пациентов "узкими" специалистами (онколог, гинеколог, инфекционист и др.) проводился по показаниям. Установленный диагноз злокачественного новообразования и предракового состояния во всех случаях подтверждался морфологически.

Формирование обследуемых групп проводилось по правилам проведения клинических испытаний, у всех пациентов было взято «информированное согласие» на участие в исследованиях. Научно-исследовательская работа проводилась в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013 г.), и была предварительно одобрена «Комитетом по этике».

Статистическая обработка полученных результатов исследования проводилась с использованием программного обеспечения Statistica 10.0, а также корреляционно-регрессионным анализом. Изучалась зависимость между относительным вкладом в светорассеивание монохроматического лазерного излучения на частицах слюны определённого размера и нозологическими формами заболеваний, объединённых в соответствующие группы по сходным патоморфологическим признакам.

Требования к забору слюны сводились к следующему: после ополаскивания водой ротовой полости слюна собиралась в пластиковую пробирку или «контейнер для забора биоматериала» натощак не ранее 4-х часов с момента последнего приёма пищи и/или медикаментов, к ней добавлялось 5 мл. физиологического раствора хлорида натрия (в таком виде РГС может храниться до исследования неограниченное время при температуре -20-30 градусов Цельсия в морозильной камере холодильника). Затем образец РГС помещался в центрифужную пробирку и проводилось центрифугирование при 2500 об/мин, после которого надосадочная жидкость помещалась в кювету лазерного спектроскопа для проведения самого исследования.

Проведенный на предварительном этапе работы анализ зависимости спектров слюны от возраста, пола, сезона и этнической принадлежности показал, что влияние вышеперечисленных факторов на спектроскопические характеристики ничтожно малы и ими можно пренебречь.

Результаты

Исследование было подразделено на несколько этапов, первым из которых являлось определение характерных особенностей спектра РГС практически здоровых людей. На рис. 2 представлен наиболее типичный спектр РГС практически здоровых людей.

Рис. 2. Наиболее типичный спектр РГС практически здоровых людей

Основными особенностями, характеризующими РГС-спектры практически здоровых людей, являлись мономодальность распределения частиц слюны по размеру: максимальный вклад (100%) в светорассеяние на наночастицах среднего гидродинамического диаметра 178 нм и отсутствие наночастиц в спектральных поддиапазонах 0-178 нм и 179-5000 нм, что позволяет использовать данные усреднённые значения в качестве референтных показателей при дальнейших расчетах.

Второй этап исследований проводился с целью определения сдвигов в субфракциях наночастиц слюны пациентов с общесоматическими заболеваниями матки. На рис. 3 представлен наиболее типичный спектр РГС пациентов с общесоматической воспалительной патологией матки.

Рис. 3. Наиболее типичный спектр РГС пациент с общесоматической патологией матки

РГС-спектры лиц с общесоматическими заболеваниями матки воспалительной этиологии характеризовались тремя и более пиками (модами) распределения частиц слюны по размеру, с наибольшим вкладом (68%) в светорассеяние на наночастицах с гидродинамическим диаметром более 1000 нм. Вклад наночастиц мелкого поддиапазона спектра 5 нм составлял 9%, среднего (240 нм) – 23%.

На рис. 4 приведены результаты исследований РГС пациента с предраком матки.

Рис. 4. Наиболее типичный спектр РГС больных с предраковым заболеванием матки

РГС-спектры лиц с предраковыми заболеваниями матки характеризовались четырьмя и более пиками (модами) распределения частиц слюны по размеру с наибольшим вкладом в светорассеяние (43%) частиц мелкой фракции 7 нм. Средний диапазон спектра заполнялся наночастицами диаметром 54 нм при вкладе в рассеяние света 33%. Крупные агломераты частиц диаметром свыше 1000 нм давали суммарный вклад в светорассеяние 24%.

Спектры больных со злокачественными новообразованиями шейки матки характеризовались тремя и более пиками (модами) распределения частиц слюны по размеру с наибольшим вкладом (55%) в светорассеяние на наночастицах с гидродинамическим диаметром 14 нм, 31%-ным вкладом в светорассеяние частиц 54 нм в среднем поддиапазоне спектра и 14%-ном вкладом в рассеяние света на частицах крупного размера 929 нм (рис. 5).

Рис. 5. Наиболее типичный спектр РГС больных с РШМ

Обращает внимание факт обнаружения методом МАН наночастиц размером 54 нм во всех образцах РГС больных с ВПЧ-индуцированными предраковыми и онкологическими заболеваниями.

По итоговым результатам исследований методом МАН было установлено, что спектроскопические характеристики РГС пациентов с ВПЧ-индуцированным раком шейки матки и предраковыми заболеваниями статистически достоверно отличались от таковых у здоровых пациентов и больных с общесоматическими заболеваниями тех же локализаций (таб. 2).

Таблица 2

Значения показателей дифференцированности спектров слюны практически здоровых лиц и больных с общесоматическими, предраковыми и онкологическими заболеваниями матки, %

Состояние здоровья

Практическое здоровье

Общесоматические заболевания матки

Предраковые заболевания матки

Рак шейки матки

Практическое здоровье

-

75

86

91

Общесоматические заболевания матки

75

-

72

84

Предраковые заболевания матки

86

72

-

70

Рак шейки матки

91

84

70

-

Оценка диагностической информативности метода МАН проводилась с требованием унификации условий проведения теста. Для обеспечения воспроизводимости результатов исследований были стандартизированы следующие его этапы: подготовка обследуемых, взятие и хранение образцов биоматериала, выбор аналитического метода исследования.

Для расчета диагностической информативности метода МАН использовались результаты исследования показателей у здоровых лиц – для установления диагностической специфичности, у больных - для установления диагностической чувствительности метода; во всех группах обследуемых - для расчета диагностической эффективности теста.

Диагностическая чувствительность (1) представляла собой процентное выражение частоты истинно положительных результатов исследования у больных с ЗНО:

Диагностическая чувствительность = (ИП/(ИП+ЛО))х100%,     (1)

где ИП – истинно положительные результаты, ЛО – ложноотрицательные результаты.

Диагностическая специфичность (2) теста оценивалась как процентное выражение частоты истинно отрицательных результатов у здоровых лиц:

Диагностическая специфичность = (ИО/(ИО+ЛП))х100%,    (2)

где ЛП – ложноположительные результаты, ИО – истинно отрицательные результаты.

Диагностическая эффективность (3) метода определялась процентным отношением истинных, т.е. соответствующих состоянию обследуемых пациентов результатов теста, к общему числу полученных результатов:

Диагностическая эффективность = ((ИО+ИП)/(ИП+ИО+ЛП+ЛО))х100%,    (3)

Показатель предсказательной ценности положительного результата (4) рассчитывался по формуле:

Предсказательная ценность положительного результата = (ИП/(ИП+ЛП))х100%,     (4)

и применялся для оценки вероятности наличия заболевания у обследуемого с положительным результатом теста.

Показатель предсказательной ценности отрицательного результата (5) рассчитывался по формуле:

Предсказательная ценность отрицательного результата = (ИО/(ИО+ЛО))х100%,      (5)

и применялся для оценки вероятности отсутствия заболевания у обследуемого с отрицательным результатом тестирования.

Показатель диагностической специфичности метода МАН, вычисленный по группе практически здоровых лиц, составил 92%, диагностическая чувствительность метода в отношении РШМ составила 91%, показатель диагностической эффективности составлял 89%, предсказательная ценность положительного результата – 89%, предсказательная ценность отрицательного результата – 93%.

Обсуждение

Таким образом, слюна, как и кровь, содержит множество наночастиц, включая молекулы белка, нуклеиновых кислот, липопротеинов, вирусных частиц, что отражает патофизиологический статус пациента (его гомеостаз) на момент исследования; однако, в отличие от других биологических жидкостей, диагностика заболеваний по слюне предлагает простой, недорогой, безопасный и неинвазивный подход для выявления местных и органных патологических процессов, и обладает высоким потенциалом как один из элементов развития современных высокоточных методов лабораторной диагностики. МАН позволяет выявить и оценить изменения в системе гомеостаза неинвазивным способом – по слюне, обеспечивая при этом высокую точность и экспрессность исследований. Исследования выполняются с минимальным объемом РГС, подготовка которого обеспечивает сохранение уникальной нативной структуры ее частиц, с быстрой регистрацией математически обработанных результатов.

Как было показано, в ходе проведения многоэтапных спектрометрических исследований РГС у больных со злокачественными новообразованиями и предраковыми заболеваниями шейки матки в образцах слюны обнаруживались мелкие наночастицы с высоким вкладом в светорассеяние, не детектируемые (или малодетектируемые) в других группах (практически здоровые и больные с общесоматическими заболеваниями той же локализации), что наиболее вероятно связано с наночастицами-метаболитами, вырабатываемыми морфологически изменённой тканью, и попадающими в слюну через кровь, а также с реакцией иммунной системы (выработка антител), а также образованием наночастиц в организме при сопутствующих основному диагнозу синдромальных сдвигах в системе гомеостаза. Также практически значимым может явиться обнаруженный и статистически достоверный феномен присутствия в исследуемой биологической жидкости (РГС) ВПЧ-индуцированных заболеваний наночастиц диаметром 54 нм, что может быть обусловлено детекцией вирусных частиц прямым методом.

Выводы

Таким образом, значение слюны как биоматериала для диагностики ВПЧ и ВПЧ-индуцированных заболеваний лазерными технологиями лабораторных исследований трудно переоценить, что делает необходимым рассматривать МАН в качестве альтернативного существующим метода неинвазивного скрининга злокачественных новообразований и предраковых заболеваний на доклиническом этапе.

Учитывая огромное количество людей, болеющих раком, во всём мире возрастает обеспокоенность его настоящими и долгосрочными последствиями, что послужило поводом к изучению актуальной проблемы современного человечества – борьбе с возрастающей заболеваемостью раком и разработке более совершенных методов диагностики злокачественных новообразований. В работе был описан алгоритм исследования нативной биологической жидкости (слюна), представлены принципиальная схема и принцип работы монохромного анализатора наночастиц, разработаны правила забора биоматериала и подготовки образцов слюны к исследованию, дано подробное описание этапов исследования и результатов их проведения.

Установлено, что спектр РГС практически здоровых людей имеет мономодальное распределение наночастиц по размеру с преимущественным вкладом в светорассеяние на частицах среднего поддиапазона спектра. Спектральные характеристики слюны больных с ВПЧ-индуцированными предраковыми и онкологическими заболеваниями статистически достоверно (р<0,001) дифференцировались от спектров слюны практически здоровых лиц и пациентов с общесоматическими заболеваниями тех же локализаций высокими показателями вклада в светорассеяние на частицах малого гидродинамического диаметра.

Неоспоримыми преимуществами МАН для скрининга ВПЧ-индуцированного рака и формирования ГПОР являются:

  • объективность получаемых результатов тестирования;
  • возможность дифференциальной диагностики РШМ с предраковыми и общесоматическими заболеваниями матки по слюне;
  • неинвазивность забора биоматериала, что практически исключает вероятность заражения медперсонала заболеваниями, передающимися через кровь;
  • быстрое получение результатов тестирования;
  • низкая стоимость.

Внедрение МАН-диагностики в практическое здравоохранение позволит врачам ускорить постановку диагноза и определиться с методами радикального лечения, контролируя его эффективность.

Текст статьи
  1. Doorbar J., Quint W., Banks L., Bravo I.G., Stoler M., Broker T.R., Stanley M.A. The biology and life-cycle of human papillomaviruses. Vaccine. 2012(20);30 Suppl 5:F55-70. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2012.06.083
  2. Giuliani E., Rollo F., Donà M.G., Garbuglia A.R. Human Papillomavirus Oral Infection: Review of Methodological Aspects and Epidemiology. Pathogens. 2021;10(11):1411 https://doi.org/10.3390/pathogens10111411
  3. Egawa N., Egawa K., Griffin H., Doorbar J. Human Papillomaviruses; Epithelial Tropisms, and the Development of Neoplasia. Viruses. 2015;7(7):3863-90. https://doi.org/10.3390/v7072802
  4. Wallace N.A., Galloway D.A. Novel Functions of the Human Papillomavirus E6 Oncoproteins. Annu Rev Virol. 2015;2(1):403-23. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-100114-055021
  5. Egawa N., Doorbar J. The low-risk papillomaviruses. Virus Res. 2017(2);231:119-127. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2016.12.017
  6. Lowy D.R., Solomon D., Hildesheim A., Schiller J.T., Schiffman M. Human papillomavirus infection and the primary and secondary prevention of cervical cancer. Cancer. 2008(1);113(7 Suppl):1980-93. https://doi.org/10.1002/cncr.23704
  7. Camara H., Zhang Y., Lafferty L., Vallely A., Guy R., Kelly-Hanku A. Self-collection for HPV-based cervical screening: a qualitative evidence meta-synthesis. BMC Public Health. 2021.4;21(1):1503. https://doi.org/10.1186/s12889-021-11554-6
  8. Shaniqua L., McGraw, Ferrante J.M. Update on prevention and screening of cervical cancer. World J Clin Oncol. 2014.10;5(4):744-52. https://doi.org/10.5306/wjco.v5.i4.744
  9. Camara H., Zhang Y., Lafferty L., Vallely A., Guy R., Kelly-Hanku A. Qualitative Evidence Synthesis on Self-Collection for Human Papillomavirus-Based Cervical Screening: Protocol for Systematic Review. JMIR Res Protoc. 2020.22;9(10):e21093. https://doi.org/10.2196/21093
  10. Rositch A.F., Gravitt P.E., Smith J.E. Growing evidence that HPV infection is associated with an increase in HIV acquisition: exploring the issue of HPV vaccination. Sex Transm Infect. 2013;89(5):357. https://doi.org/10.1136/sextrans-2012-050870
  11. Shrestha T., Choi W., Kim G.E., Yang J.M., Yoon K.C. Human papilloma virus identification in ocular surface squamous neoplasia by p16 immunohistochemistry and DNA chip test: A strobe-compliant article. Medicine (Baltimore). 2019;98(2):e13944. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000013944
  12. Skinner S.R., Wheeler C.M., Romanowski B., Castellsagué X., Lazcano-Ponce E., Del Rosario-Raymundo M.R., Vallejos C., Minkina G., Pereira Da Silva D., McNeil S., Prilepskaya V., Gogotadze I., Money D., Garland S.M., Romanenko V., Harper D.M., Levin M.J., Chatterjee A., Geeraerts B., Struyf F., Dubin G., Bozonnat M.C., Rosillon D., Baril L. VIVIANE Study Group. Progression of HPV infection to detectable cervical lesions or clearance in adult women: Analysis of the control arm of the VIVIANE study. Int J Cancer. 2016.15;138(10):2428-38. https://doi.org/10.1002/ijc.29971
  13. Wheeler C.M., Castellsagué X., Garland S.M., Szarewski A., Paavonen J., Naud P., Salmerón J., Chow S.N., Apter D., Kitchener H., Teixeira J.C., Skinner S.R., Jaisamrarn U., Limson G., Romanowski B., Aoki F.Y., Schwarz T.F., Poppe W.A., Bosch F.X., Harper D.M., Huh W., Hardt K., Zahaf T., Descamps D., Struyf F., Dubin G., Lehtinen M. HPV PATRICIA Study Group. Cross-protective efficacy of HPV-16/18 AS04-adjuvanted vaccine against cervical infection and precancer caused by non-vaccine oncogenic HPV types: 4-year end-of-study analysis of the randomised, double-blind PATRICIA trial. Lancet Oncol. 2012;13(1):100-10. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(11)70287-X
  14. Wang H., Zhang D., Chen Q., Hong Y. Plasma expression of miRNA-21, - 214, -34a, and -200a in patients with persistent HPV infection and cervical lesions. BMC Cancer. 2019. 23;19(1):986. https://doi.org/10.1186/s12885-019-6066-6
  15. De Sanjose S., Quint W.G.V., Alemany L., Geraets D.T., Klaustermeier J.E. Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional survey. Lancet Oncol. 2010;11:1048–1056. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(10)70230-8
  16. Damin D.C., Ziegelmann P.K., Damin A.P. Human papillomavirus infection and colorectal cancer risk: a meta-analysis. Colorectal Dis. 2013;15(8):e420–e428. https://doi.org/10.1111/codi.12257
  17. Snietura M., Waniczek D., Piglowski W., Kopec A., Nowakowska-Zajdel E., Lorenc Z. Potential role of human papilloma virus in the pathogenesis of gastric cancer. World J Gastroenterol. 2014;20(21):6632–6637. https://doi.org/10.3748/wjg.v20.i21.6632
  18. Ryser M.D., Gravitt P.E., Myers E.R. Mechanistic mathematical models: An underused platform for HPV research. Papillomavirus Res. 2017;3:46-9. https://doi.org/10.1016/j.pvr.2017.01.004
  19. Johnson H.C., Elfström K.M., Edmunds W.J. Inference of type-specific HPV transmissibility, progression and clearance rates: a mathematical modelling approach. PLoS One 2012;7:e49614. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049614
  20. Jit M., Gay N., Soldan K., Hong Choi Y., Edmunds W.J. Estimating progression rates for human papillomavirus infection from epidemiological data. Med Decis Making. 2010;30:84-98. https://doi.org/10.1177/0272989x09336140
  21. Oh H.Y., Kim M.K., Seo S., Lee J.K. Association of combined tobacco smoking and oral contraceptive use with cervical intraepithelial neoplasia 2 or 3 in Korean women. J. Epidemiol. 2016; 26(1): 22–9. https://doi.org/10.2188/jea.JE20150047
  22. Белокриницкая Т.Е., Фролова Н.И., Тарбаева Д.А., Глотова Е.Ю., Золотарёва А.А., Мальцева Т.В. Ассоциации генитальных инфекций и вируса папилломы человека как конфаундинг-факторы цервикальной интраэпителиальной неоплазии. Доктор.Ру. 2015; 2(12): 14–17. [Belokrinitskaya T.E., Frolova N.I., Tarbaeva D.A., Glotova E.Yu., Zolotareva A.A., Mal'tseva T.V. Associations of genital infections and human papillomavirus as confounding factors of cervical intraepithelial neoplasia. Doctor.Ru. 2015;2(12):14–17.(in Russian)]. https://dx.doi.org/10.18565/aig.2016.4.86-93
  23. Ломакин А.В. Изучение внутренней динамики макромолекул методом лазерной корреляционной спектроскопии. УФН 153 360–362 (1987). [Lomakin A.V. Study of the internal dynamics of macromolecules by the method of laser correlation spectroscopy Sov. Phys. Usp. 30 914–916 (1987)]. https://doi.org/10.3367/UFNr.0153.198710j.0360
  24. Максимова Е.А., Бурейко С.Ф., Левин С.Б., Державец Л.М. Метод двумерной корреляционной спектроскопии для улучшения аппроксимации одномерных спектров. Химическая физика. 2015;34(8):55-57. [Maksimova E.A., Bureiko S.F., Levin S.B., Derzhavets L.M. Russian Journal of Physical Chemistry B. 2015;34(8):55-57]. https://doi.org/10.7868/S0207401X15080130
  25. Liokumovich L., Muravyov K., Skliarov P., Ushakov N. Signal detection algorithms for interferometric sensors with harmonic phase modulation: miscalibration of modulation parameters. Applied Optics. 2018;57:7127-7134 https://doi.org/10.1364/AO.57.007127
  26. Величко Е.Н., Непомнящая Э.К., Соколов А.В., Кудряшова Т.Ю. Лазерный корреляционный спектрометр для оценки размеров и динамики изменения размеров структур в биологических жидкостях. Оптика и спектроскопия. 2020;129(7):950. Velichko E.N., Nepomnyashchaya E.K., Sokolov A.V., Kudryashova T.Yu. Laser Correlation Spectrometer for Assessing the Size and Dynamics of Changes in the Size of Structures in Biological Fluids. Optics and Spectroscopy. 2020;128:959–963. https://doi.org/10.21883/OS.2020.07.49567.63-20
  27. Liokumovich L.B., Kostromitin A.O., Ushakov N.A., Kudryashov A.V. Method for Measuring Laser Frequency Noise. J Appl Spectrosc. 2020;86:1106–1112. https://doi.org/10.1007/s10812-020-00947-x
  28. Kotov O.I., Liokumovich L.B., Markov S.I., Medvedev A.V., Nikolaev V.M. Remote interferometer with polarizing beam splitting. Tech. Phys. Lett. 2000;26:415–417. https://doi.org/10.1134/1.1262863
  29. Носкин В. А. Лазерная корреляционная спектроскопия квазиупругого рассеяния. УФН 153 358–360 (1987). [Noskin V. A. Laser correlation spectroscopy of quasielastic scattering. Sov. Phys. Usp. 30 913–914 (1987)]. https://doi.org/10.1070/PU1987v030n10ABEH002972
  30. Хлебцов Н.Г., Никифоров В.В., Мельников А.Г., Меркулова Т.К., Сердобинцев Л.Н. Спектроскопия упругого рассеяния растворов капсульного белка чумного микроба. Biopolymers and cell.1990; 6(2):81-87.6, 81-87. [Khebtsou N. G., Nikiforov V. V., Melnikov A. G., Merkulova T. K., Serdobintsev L. N. Elastic scattering spectroscopy of yersinia pestis capsular protein solutions. Biopolym. Cell. 1990;6(2):81-87]. https://doi.org/10.7124/bc.000260
  31. Николаев А. И., Антонова И. Н., Донская О. С., Владимирова Л. Г. Алгоритм анализа ЛК-спектров для неинвазивной диагностики заболеваний по образцам ротоглоточного смыва. Медицинский алфавит.2019;4(35):23-27. Nikolaev A.I., Antonova I.N., Donskaya O.S., Vladimirova L.G. LC‑spectra analysis algorithm for non‑invasive diagnostics by oropharyngeal washout samples. Medical alphabet. 2019;4(35):23-27. https://doi.org/10.33667/2078-5631-2019-4-35(410)-23-27
  32. Nepomniashchaia E.K., Velichko E.N., Aksenov E.T. Inverse problem of laser correlation spectroscopy for analysis of polydisperse solutions of nanoparticles. Journal of Physics: Conference Series,769 012025. https://doi.org/10.1088/1742-6596/769/1/012025
  33. Stetefeld J., McKenna S.A., Patel T.R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophys. Rev., 2016(8):409–427. https://doi.org/10.1007/s12551-016-0218-6
  34. Малек А.В., Самсонов Р.В., Кьези А. Перспективы разработки методов диагностики и мониторинга онкологических заболеваний на основе анализа экзосом, секретируемых опухолевыми клетками. Российский биотерапевтический журнал. 2015;14(4):9-18. [Malek A.V., Samsonov R.B., Chiesi A. Development of cancer diagnostics and monitoring methods based on analysis of tumor-derived exosomes. Russian Journal of Biotherapy. 2015;14(4):9-18. (In Russ.)]. https://doi.org/10.17650/1726-9784-2015-14-4-9-18
  35. Südhof T. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 2014.(17);53(47):12696-717. https://doi.org/10.1002/anie.201406359
  36. Xu R. Light scattering: A review of particle characterization applications. Particuology, 2015(18):11-21. https://doi.org/10.1016/j.partic.2014.05.002
  37. Gulari E., Chu B., Gulari E., Tsunashima Y. Photon correlation spectroscopy of particle distributions. Journal of Chemical Physics. 1979;70:3965-3972. https://doi.org/10.1063/1.437950
  38. Lebedev A.D., Ivanova M.A., Lomakin A.V., Noskin V.A. Heterodyne quasi-elastic light-scattering instrument for biomedical diagnostics. Appl Opt. 1997(20);36(30):7518-https://doi.org/10.1364/ao.36.007518
  39. Chayen N., Dieckmann M., Dierks K., Fromme P. Ann N.Y. Size and shape determination of proteins in solution by a noninvasive depolarized dynamic light scattering instrument. Acad Sci. 2004;1027:20-7. https://doi.org/10.1196/annals.1324.003
  40. Mogridge J. Using light scattering to determine the stoichiometry of protein complexes. Methods Mol Biol. 2004;261:113-8. https://doi.org/10.1385/1-59259-762-9:113
  41. Gast K., Fiedler C. Dynamic and static light scattering of intrinsically disordered proteins. Methods Mol Biol. 2012;896:137-61. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-3704-8_9
  42. Welch H., Black W. Overdiagnosis in cancer. J Natl Cancer Inst. 2010.(5);102(9):605-13. https://doi.org/10.1093/jnci/djq099
Список литературы
Ведется прием статей
Прием материалов
c 13 августа по 19 августа
Осталось 3 дня до окончания
Публикация электронной версии статьи происходит сразу после оплаты
Справка о публикации
сразу после оплаты
Размещение электронной версии журнала
23 августа
Загрузка в eLibrary
23 августа
Рассылка печатных экземпляров
02 сентября