Лазерные технологии в вирусологии: монохромный анализ наночастиц в диагностике ВПЧ-индуцированных заболеваний по слюне

Введение

В современной вирусологии одной из актуальных задач является проблема ранней неинвазивной диагностики заболеваний, причиной которых является вирус папилломы человека (ВПЧ), приводящий к более чем 300-тысячной ежегодной смертности мирового населения [1]. Болезни, индуцированные ВПЧ, характеризуются бессимптомной начальной фазой (что затрудняет раннюю диагностику) и осложнениями, связанными с ВПЧ индуцированным канцерогенезом [2]. Персистируя в организме носителя неограниченно долго и не проникая в кровь, ВПЧ поражает базальные клетки слизистых оболочек урогенитального тракта, обеспечивая перманентное инфицирование клеток эпителия [3].

ВПЧ относится к ДНК-содержащей разновидности папилломавирусов, насчитывающих более 200 штаммов, которые в зависимости от канцерогенных способностей подразделяются на вирусы высокого онкогенного потенциала (типы 16, 18 и другие) и низкого (типы 6, 11 и другие) риска развития злокачественных опухолей [4].

Подавляющее большинство случаев развития рака шейки матки и других смежных анатомо-физиологических областей провоцируется ВПЧ 16 и 18 типов [5]. ВПЧ 6 и 11 типов являются причиной появления аногенитальных бородавок и респираторного папилломатоза [6].

Инкубационный период ВПЧ от нескольких месяцев до нескольких лет [7]. Инфицирование человека может происходить как одним, так и несколькими типами ВПЧ [8]. Первичное и вторичное ослабление иммунитета, гормональная терапия, авитаминоз, стресс, вредные привычки являются состояниями, способствующими инфицированию человека вирусом ВПЧ и дальнейшему развитию заболевания и его осложнений [9].

Рандомизированными клиническими исследованиями показана корреляция между ВПЧ и раком шейки матки (РШМ), заднего прохода и в некоторых случаях рака ротовой полости и гортани, среди которых РШМ является одним из самых распространенных злокачественных новообразований у женщин (более 550 тысяч новых случаев в год и свыше 300 тысяч летальных исходов) [10]. По статистическим расчётам ВПЧ повышает риск развития онкологического заболевания в организме его носителя более чем в несколько сотен раз, протекая в организме преимущественно латентно, сопровождаясь клинической симптоматикой лишь при развитии рака [11].

В связи с этим, одной из основных задач выявления ВПЧ, сопряженного с высоким риском канцерогенных эффектов, является ранняя диагностика индуцированных им предраковых изменений [12]. Для этого в арсенале диагностических методов имеются цитологическое, кольпоскопическое и гистологическое исследования, а также лабораторные молекулярно-биологические тесты, позволяющие детектировать наличие инфекции в организме и выполнять генотипирование ВПЧ [13]. Цитологическим анализом мазка верифицируются изменения морфологической структуры клеток, позволяющий выявлять случаи легкой дисплазии [14]. Одними из недостатков данного метода является субъективная трактовка его результатов, зависящая от квалифицированности специалиста-цитолога, и низкие показатели чувствительности в отношении тяжелой дисплазии и рака, колеблющиеся в диапазоне от 18 до 85 процентов [15]. Диагностическая чувствительность кольпоскопического метода по литературным данным составляет 70-80 процентов, требуя при этом оснащённого специализированного кабинета с оборудованием и подготовленным персоналом [16]. Гистологическое исследование предоставляет возможность верифицировать диагноз, но не может играть роль скринингового метода исследования в силу его трудоёмкости [17]. Лабораторные методы выявления ВПЧ, включая ПЦР-диагностику, отвечают на вопрос наличия или отсутствия инфекции в организме обследуемого, но не позволяют дать ответы относительно степени и стадии инфекционного процесса, применяясь в итоге в комплексном обследовании наряду с другими методами исследований [18]. Серологические методы диагностики ВПЧ основаны на методике выявления антител против специфичных белков Е2, Е6 и Е7, которые являются его маркером, и гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими зондами с последующим выделением вируса с помощью моноклональных антител к его ДНК [19]. По данным некоторых исследователей сочетанное применение лабораторных и цитологических методов выявления вируса папилломы человека способно повысить показатели диагностической чувствительности в отношении рак/предрак шейки матки до 95% [20].

В настоящее время в проблеме раннего выявления ВПЧ общепризнанной является «Стратегия скрининга и наблюдения», основанная на проведение широкомасштабного скринингового обследования женщин с целью формирования ограниченного количества лиц, составляющих по результатам тестирования группу повышенного онкологического риска (ГПОР) в отношении РШМ, внутри которой проводится уточняющая диагностика с использованием гистологических, цитологических и лабораторных методов исследования [21].

Степень онкогенности различных генотипов ВПЧ не одинакова. Наибольшей опухолеиндуцирующей способностью обладают 16 и 18 типы вируса папилломы человека, имеющие диаметр вирусных частиц 53-55 нм, состоящих из 72 капсомеров и лишённых внешней оболочки [22].

В связи с высокой социальной значимостью ВПЧ и ВПЧ-индуцированных заболеваний актуальной становится проблема разработки методологии неинвазивного скрининга населения, которая позволила бы прямым методом обнаруживать вирус в биологических жидкостях человека, формировать по результатам исследования ГПОР, а также диагностировать ВПЧ-ассоциированные предраковые состояния и злокачественные новообразования.

Метод монохромного анализа наночастиц (МАН) является усовершенствованной модификацией метода лазерно-корреляционной спектроскопии (ЛКС) [23], что обусловливает их широкое применение в приборах различных фирм для медицинских и биологических исследований [24]. По сравнению с другими методами медико-биологических исследований, метод МАН обладает рядом существенных преимуществ: широким диапазоном исследуемых фракций, возможностью одновременного анализа частиц разных гидродинамиических диаметров (структурно-функциональный анализ молекулярных ингредиентов биологических жидкостей), учётом характера межмолекулярных взаимодействий отдельных ингредиентов, достаточностью минимального количества исследуемого биоматериала, простой процедурой подготовки образцов к анализу, высокой скоростью измерений изучаемого образца и получения качественной и количественной информации [25]. [Лазерная спектроскопия, в целом, и МАН, в частности, основаны на методологии динамического светорассеяния (ДС). Для измерения таких спектров применяются методы оптического смешения на основе гетеродинирования и исследования самобиений частот рассеянного света [26].

Метод гетеродинирования заключается в смешении опорного лазерного излучения и излучения, рассеянного на исследуемом образце, на чувствительном элементе фотоприемника [27]. В этом случае фототок пропорционален квадрату суммы поля опорного излучения и поля рассеянного излучения [28]. Сущность метода самобиений состоит в том, что свет, рассеянный исследуемым участком образца, направляется на фотоприемник, на котором и возникают биения между различными частотными компонентами спектра падающего света [29]. При этом ток фотоприемника оказывается промодулированым по амплитуде частотами биений флуктуаций концентраций частиц под воздействием света, рассеянного на исследуемом образце от нуля до ширины спектра рассеяния [30]. Релаксация микроскопических флуктуаций концентрации частиц к равновесному состоянию описывается уравнением диффузии:

     (1)

где N_p – концентрация частиц, Δ – оператор Лапласа и D – коэффициент диффузии, который является ключевым параметром для определения размеров исследуемых частиц.

Решением уравнения диффузии в одномерном случае является экспоненциальная функция с показателем степени, содержащим коэффициент диффузии частиц D. В случае рассеяния света на флуктуациях концентрации монодисперсных частиц, решением является корреляционная функция поля g⁽¹⁾(τ):

     (2)

где τ – время релаксации флуктуаций концентрации частиц, которое обратно пропорционально характерной ширине Г спектра мощности света.

Спектр мощности рассеянного света в случае, когда частицы в растворе одного размера, представляет собой Лоренциан, максимум которого, расположен на частоте возбуждающего света. Ширина Лоренциана на полувысоте равна:

    (3)

где D – коэффициент диффузии частиц, q – волновой вектор рассеяния света.

Метод ДС позволяет определять размеры частиц в моно- и полидисперсных растворах. При исследовании полидисперсных растворов, каковыми являются практически все биологические жидкости, крайне важно, кроме определения размеров белков, агрегатов и везикулярных частиц не нарушать их целостность и концентрацию и, для этого, необходимо проводить измерения в их естественной среде.

Обработка рассеянного света базируется на следующем алгоритме.

Спектр мощности рассеянного света, падающего на фотоприемник, представляет собой Лоренциан, и в случае непрерывных распределений частиц по размерам имеет следующий вид:

    (4)

где А(Г) – функция распределения интенсивности рассеяния частиц по характерным для них диффузионным уширениям.

Наибольший интерес представляет вариационный метод, так как именно он используется в работе для обработки результатов [31].

Биологические жидкости находятся в тонком равновесии, определяемом ионной силой раствора, значением рН и рядом других факторов [32]. Это обстоятельство исключает возможность изучения распределения размеров белков, липопротеинов и агломератов объектов в биологических жидкостях всеми классическими методами (в том числе методами проточной цитометрии), так как эти методы требуют препарирования образцов, приводящего к изменению условий существования, входящих в них агломератов [33]. Этого недостатка лишен метод МАН, который может применяться к исходному образцу нативной биологической жидкости. Метод МАН способен также обнаруживать незначительные изменения исследуемого объекта при сравнении спектров света, рассеянного образцом до и после изменения условий. Информация об исследуемом объекте методом МАН максимально достоверна т.к. в процессе измерений состояние образца не меняется под действием внешних факторов (лазерного излучения, температуры, химических реагентов и т.д.).

При патологических процессах, происходящих в организме человека, в крови увеличивается количество циркулирующих нанокомплексов, в первую очередь, внеклеточных везикул, а их вид и состав различны в зависимости от вида патологии [34]. Впоследствии эти везикулы поступают во все органы и ткани организма. За работы по изучению везикулярного обмена информацией в организме в 2013 году была присуждена Нобелевская премия: «Нобелевская премия по физиологии и медицине (2013): везикулярный транспорт» [35].

Широко применяемые сегодня методы диагностики онкологических заболеваний, включая анализы на онкомаркеры, УЗИ и другие более дорогостоящие и сложные методы исследований, включая магниторезонансную томографию, не позволяют выявлять предраковые заболевания и ЗНО на ранней и сверхранней стадии, что, как следствие, не позволяет своевременно назначать эффективное лечение [36].

Для проведения исследований необходимо получить раствор слюны. Это требование связано с тем, что исследование неразбавленных образцов слюны не отвечает важному теоретическому аспекту метода МАН, а именно принципу «однократного рассеяния света». Выбор концентрации раствора слюны был основан на влиянии на результат измерений нескольких факторов, а именно: высокая концентрация частиц малых размеров сказывается на детектируемых размерах, связанных с взаимодействием между молекулами белка; малая концентрация крупных частиц в объеме рассеяния влияет на низкочастотную область спектра мощности и, следовательно, дополнительного пика в распределении мощности по размерам; при большой концентрации крупных частиц измерениям может мешать двукратное и многократное рассеяние; при низкой концентрации частиц в растворе уровень полезного сигнала незначительно превышает уровень шумов [37].

Для устранения возможных погрешностей при измерениях был проведен ряд тестирований НБЖ с целью определения оптимальной концентрации раствора слюны для исследований. Были получены следующие результаты: при концентрациях раствора от 1 % до 10 % в Фурье-спектрах мощности рассеянного света наблюдаются шумы, по порядку величины сопоставимые с уровнем полезного сигнала; с увеличением концентрации раствора с 1% до 20% мощность рассеянного света линейно возрастает; при концентрации свыше 20% мощность рассеянного света выходит на постоянный уровень. Такая зависимость может быть связана с процессом многократного рассеяния света исследуемым объектом. Исходя из полученных данных выбран оптимальный диапазон концентраций от 10% до 20%.

Специфика исследования биологических жидкостей человека

В медицинской диагностике для установления заболевания и контроля за его течением исследуют различные биологические жидкости организма: кровь, слюну, ликвор, мочу. Все эти жидкости имеют сложный белковый состав. Наибольший интерес имеет исследование слюны в виде ротоглоточных смывов по причине неинвазивности забора биоматериала у пациента.

Пациенту предлагают 30 мл физиологического раствора, в разовом стакане и просят тщательно (в течение 0,5-1 мин.) прополоскать полость рта и глотки и сплюнуть жидкость обратно в стакан. Из полученной взвеси микропипеткой объемом 1000 мкл отбирают 1 мл в стерильную одноразовую пробирку, закупоривают и центрифугируют в при 2500 об/мин в течение 5 мин. 0,8 мл надосадочной жидкости осторожно (чтобы не задеть осадок) переносят в кювету спектроскопа для исследования. Суть предлагаемого метода заключается в анализе рассеянного света, получаемого путем просвечивания лазером биологической жидкости человека. Лазерный луч фокусируется на образце. Белки, находящиеся в жидкости, рассеивают свет, который фиксируется детектором. По характеру изменения интенсивности рассеянного света во времени можно определить, какого размера наночастицы находятся в жидкости. Размеры детектируемых молекул зависит от наличия в организме исследуемого тех или иных заболеваний. Учитывая успешность применения метода ЛКС [38], в последние годы появилась возможность усовершенствования приборной базы и программного обеспечения, что легло в основу монохромного анализатора наночастиц (МАН).

Цель настоящей работы: оценка возможностей применения лазерной технологии сканирования нативной биологической жидкости (в виде монохромного анализа наночастиц) в лабораторной скрининговой диагностике вируса папилломы человека и ВПЧ-индуцированных заболеваний неинвазивным методом по слюне. Поставленная цель решается выполнением ряда задач:

• разработка диагностического алгоритма монохромного анализа наночастиц для определения референтных значений спектральных характеристик слюны больных ВПЧ-индуцированными предраковыми заболеваниями и раком шейки матки (основная группа), общесоматическими заболеваниями той же локализации (группа сравнения) и практически здоровых лиц (контрольная группа);
• определение показателей степени дифференцированности спектров слюны практически здоровых лиц от гистограмм слюны больных раком шейки матки, предраковой патологии и общесоматических заболеваний той же локализации при попарном сравнении;
• вычисление показателей диагностической эффективности тестирования (чувствительность, специфичность, эффективность, предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов).

Материалы и методы

Состав установки МАН: спектрометр лазерный с длиной волны 633 нм; персональный компьютер с эксклюзивным программным обеспечением для приёма сигнала с аналого-цифрового преобразователя и последующей обработки результатов исследования; лабораторная посуда для подготовки образцов к исследованию [39].

Спектрометр МАН состоит из следующих узлов: оптический блок; кювета для исследования биологической жидкости; гелий-неоновый лазер (длина волны - 633 нм); фотоприёмник; аналого-цифровой преобразователь (АЦП); блок питания.

Оптический блок спектрометра состоит из оптических элементов, фокусирующих лазерный на кювете с исследуемым образцом биологической жидкости и собирающих рассеянный свет от кюветы с находящейся в ней исследуемой НБЖ на фотоприемное устройство [40]. Оптический блок спектрометра выполняет фиксацию положения лазера, фотоприемного устройства и элементов формирующей оптики. Лазерный модуль состоит из гелий-неонового лазера и блока его питания. Фотоприемное устройство (ФПУ) предназначено для регистрации рассеянного света от частиц исследуемого образца, преобразования его в электрический сигнал и усиления его для подачи на АЦП. Фотоприёмник обеспечивает высокую чувствительность преобразования падающего света лазера в электрический ток. АЦП представляет собой 14-разрядный преобразователь входного напряжения в диапазоне от 0 до 3 вольт в полосе частот от 0 до 10 МГц. Подача оцифрованного сигнала на компьютер осуществляется через USB-порт. Блок питания спектрометра предназначен для получения стабильного напряжения, необходимого для питания электронных устройств прибора из напряжения 220 В с частотой 50 Гц.

Принципиальная оптическая схема спектрометра МАН приведена на рис. 1.

Рис. 1. Блок-схема монохроматического анализатора наночастиц,
где 1 – лазер; 2 – кювета; 3, 4 – фотоприемные устройства; 5 – поворотный блок; 6, 7 – поляризаторы; 8 – электронный блок

Исходя из того, что объектом исследований являются жидкости, в т.ч. биологические, которые содержат в своём составе наночастицы белков, длина волны излучения устанавливалась исходя из спектров поглощения белков, воды, и крайних размеров белковых комплексов слюны порядка от 1 нм до 1000 нм. Выбор длины волны лазерного излучения в окне прозрачности спектра поглощения воды позволяет избежать потери мощности излучения за счет поглощения и, соответственно, возбуждения молекул воды. В связи с вышесказанным для исследования водных растворов слюны оптимальным является длина волны лазерного излучения 633 нм.

Метод МАН, используемый в настоящих исследованиях, суть которого заключается в модуляции лазерного излучения частотой броуновского колебания исследуемых частиц, подразумевает, что влияние фотонов света лазерного излучения не должно вносить значимых изменений в исследуемую систему. Таким образом, к рабочим узлам аппаратуры, одним из которых является лазерный модуль, предъявляются высокие требования.

Прибор МАН предназначен для исследования органических и неорганических наночастиц в жидкостях, в том числе биологических. По своим параметрам МАН не уступает зарубежным ЛК-спектрометрам (быстродействие составляет 1-5-10 минут в зависимости от количества накоплений), что может влиять на погрешность измерений, объем исследуемой жидкости от 0.5 мл до 5 мл, диапазон измеряемых размеров частиц от 1 нм до 10 мкм. Таким образом, результаты измерений показывают, что МАН позволяет получать достоверные результаты, а также исследовать полидисперсные растворы биологических жидкостей, такие как слюна и плазма крови. Применяемый способ позволяет оценить состояние организма путем прямого измерения распределения по размерам наноструктур в слюне человека по результатам МАН-исследования.

При исследовании параметров частиц методом МАН важно минимизировать влияние факторов на исследуемую среду, в том числе и нелинейные эффекты. Это связано с тем, что информация о размерах и процентном соотношении частиц в образце слюны связана с мощностью рассеянного ими света. Растворы наночастиц в слюне обычно малоконцентрированы и могут проявлять нелинейные свойства при взаимодействии с низкоинтенсивным лазерным излучением. В зависимости от свойств слюны и содержащихся в ней наночастиц, различных по форме и размерам нелинейность интенсивности выходного излучения в зависимости от входной интенсивности носит различный характер. Для автоматизации обработки выходных данных спектрометра МАН был использован аналого-цифровой преобразователь АЦП Е20-10, поставляемый фирмой LCard в комплекте с АЦП. Это позволило записывать сигнал с МАН в цифровом формате на жёсткий диск персонального компьютера. Для визуализации результатов исследования образцов применялась программа-классификатор, которая позволяла в автоматическом режиме анализировать спектры, выдавая информацию о гидродинамических размерах наночастиц и их вкладе в светорассеяние. Алгоритм работы программы-классификатора основан на т.н. методе «теория групп», когда индивидуальные спектры дифференцируются между собой в 32-мерном пространстве [41]. Для каждой из двух сравниваемых групп проводились границы зон, которые соответствовали дисперсиям распределений "две сигмы". Масштабы по осям отображались в логарифмическом масштабе. Результаты измерения образцов слюны методом МАН представляются в виде гистограмм, описывающих вид функции распределения частиц слюны по размерам (диаметру) и вкладу в светорассеяние, при этом высота пиков пропорциональна относительному вкладу частиц данного диаметра в суммарный спектр лазерного излучения в заданном частотном диапазоне. Весь диапазон спектра от 1 до 10000 нм условно разделялся на пять фракций (поддиапазонов) соответственно размерам детектируемых наночастиц: 1 – 10 нм; 11 – 30 нм; 31 – 70 нм; 71 – 150 нм; > 151нм. Статанализ данных проводился с вычислением показателя «среднее арифметическое» и его стандартной ошибки, а в случае попарного сравнения результатов исследования, полученных от двух и более групп, – метод «попарного множественного сравнения» [42].

Для оценки достоверности показаний МАН проводились измерения опытных образцов, которые состояли из сферических наночастиц латекса диаметром 100 нм и в виде суспензии находились в водном растворе. Их размеры, полученные после обработки данных в программе-классификаторе составляли 96-102 нм. По серии проведенных измерений относительная погрешность составила не более 4%. Результаты замеров частиц латекса с диаметром 100 нм в водной суспензии показаны в табл. 1.

Таблица 1

Результаты замеров сферических наночастиц латекса диаметром 100 нм

Важным фактором в измерениях, проводимых методом МАН, является время экспозиции. Измерения проводились несколько раз подряд (время одного измерения составляет 10 минут), пробирка с раствором не извлекалась из кюветы и воздействие на образец лазерного излучения было постоянным.

Забор слюны у пациентов проводился строго натощак, перед взятием биоматериала проводилось предварительное полоскание полости рта в течение 10-15 секунд 25-40 мл изотонического раствора натрия хлорида. Хранение образцов осуществлялось при комнатной температуре – в течение 6 ч., при температуре от 2°С до 8°С – в течение 3 суток, при температуре минус 20°С – в течение полугода, при температуре минус 70°С – длительно.

Определение размеров наночастиц слюны проводилось следующим образом: раствор слюны в виде ротоглоточного смыва (РГС) после 10-минутного центрифугирования при 2500 об/мин микропипеткой отбирался и помещался в кювету МАН, проводилось три измерения подряд в течение 10 минут каждое, раствор постоянно находился под воздействием лазерного излучения, при комнатной температуре.

Исследования слюны в виде РГС методом МАН проводилось в «Центре европейской и восточной медицины» с 2019 по 2021 год, и были обследованы 195 пациентов. Большинство обследованных (более 98%) пациентов были женщинами в возрасте от 20 до 69 лет. Заключение о состоянии здоровья давалось на основании результатов комплексного медицинского обследования больных в медицинских учреждениях по месту жительства. По превалирующей симптоматике основного патологического процесса исследуемые были разделены на три группы: две основных: а) больные с верифицированными случаями РШМ (30 наблюдений) и б) пациенты с предраковыми заболеваниями шейки матки (45 наблюдений), группу сравнения (больные с общесоматическими заболеваниями матки преимущественно воспалительной этиологии (67 наблюдений) и контрольную группу (практически здоровые пациенты в количестве 53 человек). Всем пациентам проводилась лазерная спектроскопия слюны.

Наблюдаемые случаи РШМ включали плоскоклеточный рак следующих гистологических типов: ороговевающий (высокодифференцированный), неороговевающий (дифференцированный) и с низкой дифференцировкой (низкодифференцированный), базалоидный, кондиломатозный (бородавчатый), лимфоэпителиомоподобный, папиллярный (сосочковый), а также некоторые виды аденокарциномы шейки матки (эндофитные, экзофитные и смешанные).

Предраковые заболевания матки были представлены эрозиями, полипами, дисплазиями средней и тяжёлой степени, кондиломами шейки матки.

Общесоматические заболевания матки преимущественно воспалительного характера подразделялись на эндометрит, эндомиометрит, метроэндометрит, параметрит, периметрит и панметрит, которые объективно устанавливались и подтверждались морфологически.

Группа практически здоровые пациентов состояла из лиц, при углублённом обследовании которых не было выявлено патологии.

Осмотр пациентов "узкими" специалистами (онколог, гинеколог, инфекционист и др.) проводился по показаниям. Установленный диагноз злокачественного новообразования и предракового состояния во всех случаях подтверждался морфологически.

Формирование обследуемых групп проводилось по правилам проведения клинических испытаний, у всех пациентов было взято «информированное согласие» на участие в исследованиях. Научно-исследовательская работа проводилась в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013 г.), и была предварительно одобрена «Комитетом по этике».

Статистическая обработка полученных результатов исследования проводилась с использованием программного обеспечения Statistica 10.0, а также корреляционно-регрессионным анализом. Изучалась зависимость между относительным вкладом в светорассеивание монохроматического лазерного излучения на частицах слюны определённого размера и нозологическими формами заболеваний, объединённых в соответствующие группы по сходным патоморфологическим признакам.

Требования к забору слюны сводились к следующему: после ополаскивания водой ротовой полости слюна собиралась в пластиковую пробирку или «контейнер для забора биоматериала» натощак не ранее 4-х часов с момента последнего приёма пищи и/или медикаментов, к ней добавлялось 5 мл. физиологического раствора хлорида натрия (в таком виде РГС может храниться до исследования неограниченное время при температуре -20-30 градусов Цельсия в морозильной камере холодильника). Затем образец РГС помещался в центрифужную пробирку и проводилось центрифугирование при 2500 об/мин, после которого надосадочная жидкость помещалась в кювету лазерного спектроскопа для проведения самого исследования.

Проведенный на предварительном этапе работы анализ зависимости спектров слюны от возраста, пола, сезона и этнической принадлежности показал, что влияние вышеперечисленных факторов на спектроскопические характеристики ничтожно малы и ими можно пренебречь.

Результаты

Исследование было подразделено на несколько этапов, первым из которых являлось определение характерных особенностей спектра РГС практически здоровых людей. На рис. 2 представлен наиболее типичный спектр РГС практически здоровых людей.

Рис. 2. Наиболее типичный спектр РГС практически здоровых людей

Основными особенностями, характеризующими РГС-спектры практически здоровых людей, являлись мономодальность распределения частиц слюны по размеру: максимальный вклад (100%) в светорассеяние на наночастицах среднего гидродинамического диаметра 178 нм и отсутствие наночастиц в спектральных поддиапазонах 0-178 нм и 179-5000 нм, что позволяет использовать данные усреднённые значения в качестве референтных показателей при дальнейших расчетах.

Второй этап исследований проводился с целью определения сдвигов в субфракциях наночастиц слюны пациентов с общесоматическими заболеваниями матки. На рис. 3 представлен наиболее типичный спектр РГС пациентов с общесоматической воспалительной патологией матки.

Рис. 3. Наиболее типичный спектр РГС пациент с общесоматической патологией матки

РГС-спектры лиц с общесоматическими заболеваниями матки воспалительной этиологии характеризовались тремя и более пиками (модами) распределения частиц слюны по размеру, с наибольшим вкладом (68%) в светорассеяние на наночастицах с гидродинамическим диаметром более 1000 нм. Вклад наночастиц мелкого поддиапазона спектра 5 нм составлял 9%, среднего (240 нм) – 23%.

На рис. 4 приведены результаты исследований РГС пациента с предраком матки.

Рис. 4. Наиболее типичный спектр РГС больных с предраковым заболеванием матки

РГС-спектры лиц с предраковыми заболеваниями матки характеризовались четырьмя и более пиками (модами) распределения частиц слюны по размеру с наибольшим вкладом в светорассеяние (43%) частиц мелкой фракции 7 нм. Средний диапазон спектра заполнялся наночастицами диаметром 54 нм при вкладе в рассеяние света 33%. Крупные агломераты частиц диаметром свыше 1000 нм давали суммарный вклад в светорассеяние 24%.

Спектры больных со злокачественными новообразованиями шейки матки характеризовались тремя и более пиками (модами) распределения частиц слюны по размеру с наибольшим вкладом (55%) в светорассеяние на наночастицах с гидродинамическим диаметром 14 нм, 31%-ным вкладом в светорассеяние частиц 54 нм в среднем поддиапазоне спектра и 14%-ном вкладом в рассеяние света на частицах крупного размера 929 нм (рис. 5).

Рис. 5. Наиболее типичный спектр РГС больных с РШМ

Обращает внимание факт обнаружения методом МАН наночастиц размером 54 нм во всех образцах РГС больных с ВПЧ-индуцированными предраковыми и онкологическими заболеваниями.

По итоговым результатам исследований методом МАН было установлено, что спектроскопические характеристики РГС пациентов с ВПЧ-индуцированным раком шейки матки и предраковыми заболеваниями статистически достоверно отличались от таковых у здоровых пациентов и больных с общесоматическими заболеваниями тех же локализаций (таб. 2).

Таблица 2

Значения показателей дифференцированности спектров слюны практически здоровых лиц и больных с общесоматическими, предраковыми и онкологическими заболеваниями матки, %

Оценка диагностической информативности метода МАН проводилась с требованием унификации условий проведения теста. Для обеспечения воспроизводимости результатов исследований были стандартизированы следующие его этапы: подготовка обследуемых, взятие и хранение образцов биоматериала, выбор аналитического метода исследования.

Для расчета диагностической информативности метода МАН использовались результаты исследования показателей у здоровых лиц – для установления диагностической специфичности, у больных - для установления диагностической чувствительности метода; во всех группах обследуемых - для расчета диагностической эффективности теста.

Диагностическая чувствительность (1) представляла собой процентное выражение частоты истинно положительных результатов исследования у больных с ЗНО:

Диагностическая чувствительность = (ИП/(ИП+ЛО))х100%,     (1)

где ИП – истинно положительные результаты, ЛО – ложноотрицательные результаты.

Диагностическая специфичность (2) теста оценивалась как процентное выражение частоты истинно отрицательных результатов у здоровых лиц:

Диагностическая специфичность = (ИО/(ИО+ЛП))х100%,    (2)

где ЛП – ложноположительные результаты, ИО – истинно отрицательные результаты.

Диагностическая эффективность (3) метода определялась процентным отношением истинных, т.е. соответствующих состоянию обследуемых пациентов результатов теста, к общему числу полученных результатов:

Диагностическая эффективность = ((ИО+ИП)/(ИП+ИО+ЛП+ЛО))х100%,    (3)

Показатель предсказательной ценности положительного результата (4) рассчитывался по формуле:

Предсказательная ценность положительного результата = (ИП/(ИП+ЛП))х100%,     (4)

и применялся для оценки вероятности наличия заболевания у обследуемого с положительным результатом теста.

Показатель предсказательной ценности отрицательного результата (5) рассчитывался по формуле:

Предсказательная ценность отрицательного результата = (ИО/(ИО+ЛО))х100%,      (5)

и применялся для оценки вероятности отсутствия заболевания у обследуемого с отрицательным результатом тестирования.

Показатель диагностической специфичности метода МАН, вычисленный по группе практически здоровых лиц, составил 92%, диагностическая чувствительность метода в отношении РШМ составила 91%, показатель диагностической эффективности составлял 89%, предсказательная ценность положительного результата – 89%, предсказательная ценность отрицательного результата – 93%.

Обсуждение

Таким образом, слюна, как и кровь, содержит множество наночастиц, включая молекулы белка, нуклеиновых кислот, липопротеинов, вирусных частиц, что отражает патофизиологический статус пациента (его гомеостаз) на момент исследования; однако, в отличие от других биологических жидкостей, диагностика заболеваний по слюне предлагает простой, недорогой, безопасный и неинвазивный подход для выявления местных и органных патологических процессов, и обладает высоким потенциалом как один из элементов развития современных высокоточных методов лабораторной диагностики. МАН позволяет выявить и оценить изменения в системе гомеостаза неинвазивным способом – по слюне, обеспечивая при этом высокую точность и экспрессность исследований. Исследования выполняются с минимальным объемом РГС, подготовка которого обеспечивает сохранение уникальной нативной структуры ее частиц, с быстрой регистрацией математически обработанных результатов.

Как было показано, в ходе проведения многоэтапных спектрометрических исследований РГС у больных со злокачественными новообразованиями и предраковыми заболеваниями шейки матки в образцах слюны обнаруживались мелкие наночастицы с высоким вкладом в светорассеяние, не детектируемые (или малодетектируемые) в других группах (практически здоровые и больные с общесоматическими заболеваниями той же локализации), что наиболее вероятно связано с наночастицами-метаболитами, вырабатываемыми морфологически изменённой тканью, и попадающими в слюну через кровь, а также с реакцией иммунной системы (выработка антител), а также образованием наночастиц в организме при сопутствующих основному диагнозу синдромальных сдвигах в системе гомеостаза. Также практически значимым может явиться обнаруженный и статистически достоверный феномен присутствия в исследуемой биологической жидкости (РГС) ВПЧ-индуцированных заболеваний наночастиц диаметром 54 нм, что может быть обусловлено детекцией вирусных частиц прямым методом.

Выводы

Таким образом, значение слюны как биоматериала для диагностики ВПЧ и ВПЧ-индуцированных заболеваний лазерными технологиями лабораторных исследований трудно переоценить, что делает необходимым рассматривать МАН в качестве альтернативного существующим метода неинвазивного скрининга злокачественных новообразований и предраковых заболеваний на доклиническом этапе.

Учитывая огромное количество людей, болеющих раком, во всём мире возрастает обеспокоенность его настоящими и долгосрочными последствиями, что послужило поводом к изучению актуальной проблемы современного человечества – борьбе с возрастающей заболеваемостью раком и разработке более совершенных методов диагностики злокачественных новообразований. В работе был описан алгоритм исследования нативной биологической жидкости (слюна), представлены принципиальная схема и принцип работы монохромного анализатора наночастиц, разработаны правила забора биоматериала и подготовки образцов слюны к исследованию, дано подробное описание этапов исследования и результатов их проведения.

Установлено, что спектр РГС практически здоровых людей имеет мономодальное распределение наночастиц по размеру с преимущественным вкладом в светорассеяние на частицах среднего поддиапазона спектра. Спектральные характеристики слюны больных с ВПЧ-индуцированными предраковыми и онкологическими заболеваниями статистически достоверно (р<0,001) дифференцировались от спектров слюны практически здоровых лиц и пациентов с общесоматическими заболеваниями тех же локализаций высокими показателями вклада в светорассеяние на частицах малого гидродинамического диаметра.

Неоспоримыми преимуществами МАН для скрининга ВПЧ-индуцированного рака и формирования ГПОР являются:

• объективность получаемых результатов тестирования;
• возможность дифференциальной диагностики РШМ с предраковыми и общесоматическими заболеваниями матки по слюне;
• неинвазивность забора биоматериала, что практически исключает вероятность заражения медперсонала заболеваниями, передающимися через кровь;
• быстрое получение результатов тестирования;
• низкая стоимость.

Внедрение МАН-диагностики в практическое здравоохранение позволит врачам ускорить постановку диагноза и определиться с методами радикального лечения, контролируя его эффективность.