Изучение накопления бетулина в березовой коре в зависимости от сезонности и техногенного стресса

Растения, как и любые другие живые организмы, подвергаются воздействию различных стрессовых факторов, как природных (недостаток или избыток влаги, высокие или низкие температуры, нарушение почвенного покрова, патогены, вредители и др.), так и антропогенных (загрязнение атмосферного воздуха, воды, почвы, механическое воздействие). В силу того, что растения не способны к передвижению и активной защите от всех этих факторов, ими были выработаны защитные системы. Большое количество предупреждающих систем и химических соединений вовлечено в защитные механизмы растений, являющиеся результатом цепи сложных биохимических процессов [2].

Для приспособления в условиях действия стрессовых факторов окружающей в растениях усиливается синтез вторичных метаболитов, которые выполняют защитные функции, и необходимы растениям для выживания в различных экологических условиях. Вторичные метаболиты представлены большим разнообразием химических соединений, к ним относят фенолы, эфирные масла, смоляные кислоты, ростовые вещества, стерины, альдегиды, эфиры и многие другие, точное количество в настоящий момент не известно [2]. Одним из представителей данной группы веществ является бетулин – пентациклический тритерпеновый спирт с химической формулой С₃₀Н₅₀О₂, который находится в основном во внешнем слое коры березы (бересте), что обуславливает характерную белую окраску стволов данного семейства [10].

На характер и интенсивность синтезирования веществ вторичного метаболизма сильное воздействие оказывает техногенная нагрузка. Так например, экспериментально доказано, что в ответ на стрессовое воздействие ряд хвойных растений реагируют усилением производства терпенов [12]. Однако известно, что на накопление вторичных метаболитов оказывает не только техногенное влияние, но и множество других факторов. К ним можно отнести: индивидуальные и видовые особенности, возраст дерева, географическая широта и климат, природные условия местопроизрастания и сезонность. Особенно заметные изменения в растениях происходят в течение года, что связанно с цикличностью развития, наблюдается накопление или расходование тех или иных веществ в тканях. Например, в период активного роста деревьев (апрель-август) количество бетулина в бересте максимально, тогда как в осенне-зимний период (состояние покоя) отмечено наименьшее содержание изучаемых веществ в бересте [11].

Изучение закономерностей накопления вторичных метаболитов растений в условиях техногенного стресса является актуальным, так как это можно использовать как индикатор физиологического состояния как самих растений, так и для оценки качества окружающей среды [4, 11]. Кроме этого, в настоящий момент имеется недостаточно сведений в каком количестве и для каких целей синтезируются стрессовые метаболиты в растительном организме.

Березовые насаждения являются распространенным видом для озеленения городов, так как отличаются высокой экологической пластичностью, интенсивным ростом, долговечностью, обладают высокими пыле- и газоулавливающими свойствами и достаточно хорошо произрастают в условиях промышленного города. Но при ухудшении экологических условий у дерева наблюдается некроз листьев, запаздывает появление листьев, сокращаются сроки цветения, позже наступает листопад, снижается интенсивность фотосинтеза и др. [3, 9]. Ответные реакции берёзы чаще всего рассматривается на основании морфометрических показателей листьев (метод флуктуирующей асимметрии) [9], тогда как, процесс накопление вторичных метаболитов (например бетулина) в настоящий момент мало изучен.

Цель данного исследования – изучение накопления бетулина в коре березы в условиях техногенного стресса с учетом сезонности. Для этого сравнивалось количество бетулина, выделенного из проб бересты, отобранных на пробных площадях с разной антропогенной нагрузкой и в разное время года. Пробы были взяты в: лесных насаждениях в зоне воздействия Архангельского целлюлозно-бумажного комбината (АЦБК) – участок № 1; около деревни Боброво – участок № 2 (фоновый); в селитебной зоне города Архангельска в парке вдоль Ленинградского проспекта (от ул. Прокопия Галушина до ул. Кооперативная) – участок № 3.

Бетулин содержится не только в коре, но и в других частях растения, однако в меньшем количестве, он был обнаружен в корневой кожуре и листьях берез. Однако именно в коре белоствольных берез его количество максимально и достигать 30-40% от суммы всех экстрактивных веществ [1]. Поэтому для анализа отбирались пробы внешней части коры (бересты). Первый отбор проб был произведен в феврале и марте 2019 года, второй в августе и начале сентября 2019 года. Отбор проб с 10 растущих деревьев березы на высоте груди (1,5 м), примерный размер одного образца составил 5×5 см [11].

Березовые насаждения в нашей стране представлены в основном представлены двумя видами: береза повислая (лат. Betula pendula Roth.) и береза пушистая (лат. Betula pubescens Ehrh.), экспериментально было доказано, что береста обоих видов идентична по компонентному составу основных групп биологически активных веществ, присутствует бетулин, и значительного отличия в его количестве не было обнаружено [6]. Поэтому отбирались образцы коры обоих видов.

После отбора пробы подготавливали – очищали от лишайников и луба, измельчали на дробилке истирающего действия, проводили фракционирование бересты, затем определяли её влажность и зольность по методике, предложенной в ГОСТ 24027.2-80. Были получены следующие данные (см. табл.): влажность коры в весенне-зимний период составила 2,45% на первом участке; 2,07% на втором и 2,95% на третьем, в летнее-осенний период этот показатель несколько ниже на первом и третьем участке, где он составил 2,39% и 2,78% соответственно, на втором участке оказался выше – 2,23%.

Массовая доля золы, оставшаяся после сжигания коры составила в весенне-зимний период 0,09% на первом участке; 0,15% на втором и третьем участках; в пробах, отобранных в конце лета и начале осени этот показатель немного выше: 0,11% на первом; 0,17% на втором и 0,18% на третьем участке.

Таблица

Среднее значение влажности и зольности бересты на участках отбора проб в разное время года

Основная часть исследования заключалась в выделение бетулина путем экстракции его из измельченной и высушенной до воздушно-сухого состояния бересты 86%-м раствором этилового спирта в СВЧ-камере в течении 10 минут при оптимальных условиях [7]. После экстракции спирт отгонялся (до 1/3 всего объема раствора) и добавлялась дистиллированная вода, в образовавшемся при этом пересыщенном спиртоводном растворе бетулин выпадал в осадок, его отделяли фильтрованием на воронке Бюхнера с водоструйным вакуум-насосом. Затем отфильтрованный бетулин высушивали в сушильном шкафу при 60°С до постоянной массы. Проводили взвешивания и выполняли расчеты.

Для количественной оценки рассчитывался такой показатель как выход бетулина – содержание бетулина, полученного в ходе экстракции, в процентах от общей массы абсолютно сухой бересты (а.с.б.) [5]. Полученный бетулин может быть использован как биологически активное вещество (БАВ) в фармацевтической, пищевой и косметической индустрии [3].

Для проб, отобранных зимой-весной максимальное содержание бетулина в процентах от общей массы а.с.б. наблюдался на участке №1, где среднее значение составило 22,95±0,88%. На участке №2 выход бетулина в среднем равен 14,10±0,44%, на участке №3 – 17,09±0,17% от а.с.б. То есть в образцах, отобранных на фоновом участке, содержание бетулина ниже всего. Показатель содержания бетулина в коре внутри каждого участка нестабилен и варьирует, однако наблюдается общая тенденция к увеличению накопления бетулина по мере увеличения антропогенной нагрузки и ухудшения экологических условий.

Для сравнения была проведена экстракция бетулина из проб бересты, отобранных в конце лета – начале осени 2019 года. Методы пробоотбора, пробоподготовки и экстракции оставались теми же. Не смотря на явное увеличение содержания бетулина на всех участках, прослеживается такая же тенденция: на первом участке выход бетулина в среднем составил 26,08±0,68%, на втором 19,32±0,03%; на третьем 22,90±0,17% от а.с.б. (см. рис.).

Рис. Среднее значение содержания бетулина в % от а.с.б.

Наблюдаемая тенденция повышенного накопления количества бетулина в бересте деревьев, произрастающих в условиях техногенной нагрузки, характеризует ответную реакцию березовых насаждений на действие стресса, вызванного жизнедеятельностью в условиях промышленного загрязнения. Следовательно, количественное содержание бетулина в коре может применяться в качестве индикатора для оценки состояния окружающей среды в условиях техногенной нагрузки.

Кроме этого на рисунке заметно увеличение содержания бетулина в течение года, т.е. его накопление непосредственно связано с фазами развития дерева. Его количество в летне-осенний период больше на 3-5% по сравнению с зимне-весенним периодом. В период роста дерева его накопление в бересте максимально, и наоборот, в состоянии покоя наблюдается его снижение. Уменьшение содержания массы бетулина в зимний период может быть связано с тем, что это твердое мелкокристаллическое вещество, которое осыпается с коры берез, под влиянием ветра и снега [8].

Таким образом, в данной работе изучено количественное накопление бетулина (стрессового метаболита) в березовой коре в зависимости от фактора сезонности и техногенного влияния. Показано, что в летне-осенний период и по мере увеличения антропогенной нагрузки его содержание в коре деревьев максимально.