Изменчивость некоторых микросателлитных локусов ядерного генома в генетической идентификации Betula pendula Roth. из Мордовской популяции

Микросателлитные маркеры наилучшим образом подходят для идентификации и дискриминации индивидуальных генотипов, поскольку содержат большое число аллелей и возможность использовать наборы локусов позволяет получать уникальные генетические «портреты» особей с крайне низкой вероятностью случайного повторения [1, с.1].

Благодаря использованию специфических ПЦР-праймеров достигается высокая воспроизводимость результатов микросателлитного анализа [1, с.1].

Объектом данного молекулярно – генетического исследования является выборка березы повислой Betula pendula Roth., собранной на территории Республики Мордовия, р-н. Темниковский, с. Кушки, Березовая роща.

Свежие листья без видимых повреждений отбирали с ветвей, расположенных на расстоянии не менее 2 м друг от друга. Отобранные образцы нанесены на карту с помощью портативной навигационной системы. Всего было отобрано 19 образцов.

В качестве экспериментального материала для выделения ДНК были использованы недавно распустившиеся листовые пластинки. Выделение проводили по стандартному протоколу для растительных тканей с применением цетилтриметиламмониумбромида (СТАВ – метод). Данный метод позволяет получить ДНК достаточно высокой степени чистоты, что позволяет получить хорошо визуализируемые на электрофорезе продукты амплификации.

Для проведения ПЦР использовали три пары ядерных микросателлитных локусов (AF310850, AF310863, AF310873), разработанные ранее для видов рода Betula [2, с. 471-473, 3, C. 96-98] и отобранные из числа набора эффективных и стабильно амплифицирующихся локусов с четко воспроизводимыми результатами [1, с.1]. Характеристика локусов приводится в таблице. Для праймеров была оптимизирована температура отжига.

Таблица

Последовательности использованных в работе праймеров для амплификации ядерных микросателлитных локусов

Разделение продуктов ПЦР проводили методом гель-электрофореза в денатурирующем 6% полиакриламидном геле в стандартных камерах VE – 20 производства ООО «Хеликон» с размерами стекла 20 см х 20 см.

Визуализацию и графическое изображение гелей (электрофореграммы) продуктов разделения получали с помощью трансиллюминатора «КвантМ – 312Б» и фотосистемы гель-документации. В качестве маркера стандартных длин фрагментов использовали ДНК плазмиды pBR322 Е. coli, обработанную эндонуклеазой рестрикции Hpa II.

Статистический анализ микросателлитных данных изученных образцов березы из Мордовской популяции был проведен в программе GenAlEx v6.51.

В результате проведения молекулярно-генетического анализа с ядерными микросателлитными локусами и последующего генотипирования получили матрицу с многолокусными генотипами для каждого из изученных образцов березы из Мордовской популяции.

Наибольшая изменчивость наблюдается в локусе AF310850 с максимальным количеством аллелей равным 6, локусы AF310873 и AF310863 имеют по 5 аллелей.

Диапазон длин фрагментов локуса AF310873 варьирует от 120 п.н. до 140 п.н., локуса AF310850 – от 158 п.н. до 168 п.н., локуса AF310863 от 149 п.н. до 170 п.н.

Ранее высокая разрешающая способность этих микросателлитных маркеров для идентификации генотипов березы была продемонстрирована в ряде исследований. Так, для идентификации элитных генотипов клонов березы [1, с.1] было выявлено в локусе AF310850 18 аллелей в диапазоне от 156 до 194 п.н., в локусе AF310873 – 5 аллелей, варьирующих от 140 п.н. до 162 п.н., в локусе AF310863 – 13 аллелей от 121 п.н. до 147 п.н.

Из анализа полученных данных следует, что для проведения молекулярно-генетической паспортизации березы предлагается применять протестированные микросателлитные локусы: AF310850, AF310873, AF310863 (уровень полиморфизма локусов составляет 100%).

Проверка данных трех изученных микросателлитных локусов на выявление совпадающих генотипов в программе GenAlEx показала наличие двух групп деревьев с двумя образцами в каждой, причем образцы с совпадающими генотипами по трем микросателлитным локусам произрастают в непосредственной близости друг от друга. Вероятно, что семена этих образцов происходят от одного дерева, то есть эти образцы имеют родственное происхождение. Все остальные деревья имеют индивидуальные генотипы и имеют различное происхождение.

Таким образом, молекулярно-генетическая идентификация отобранных особей березы повислой из Мордовской популяции проведена с помощью специфичных трех микросателлитных локусов ядерного генома, отобранных из большого числа локусов, представленных в статьях. Отобранные для анализа ядерные микросателлитные локусы высоко полиморфны, имеют по 56 хорошо воспроизводимых аллелей, не имеют нулевых аллелей, поэтому являются удобным инструментом для генетической паспортизации и идентификации видов берез, для выявления и подтверждения гибридов берез. На основе генотипирования трех микросателлитных локусов ядерного генома для образцов березы повислой из Мордовской популяции составлены генетические паспорта. Выявление совпадающих генотипов показало наличие двух групп деревьев березы, имеющих родственное происхождение и 17 индивидуальных генотипов. Полученные данные по изменчивости трех микросателлитных локусов ядерного генома березы повислой из Мордовской популяции могут быть полезны в случае подтверждения происхождения древесины при незаконных рубках.