Применение комбинации методов очистки и анализа фракций белков на примере электрофоретического анализа амилолитических ферментов

Мужская сперма является многокомпонентной смесью секретов нескольких желёз. Жидкая фаза этой смеси играет существенную роль в окончательном созревании сперматозоидов, обеспечивая им защиту, питание, подвижность и способность достигнуть женской яйцеклетки.

Изменения в составе семенной плазмы могут оказать существенное влияние на способность спермы к оплодотворению яйцеклетки и являются диагностическим показателем нарушения функций желёз [1, с. 24-30; 2, с. 460-464].

Одним из самых важных для диагностики компонентов семенной жидкости является фермент α-гликозидаза (3.2.1.20), которая относится к группе амилолитических ферментов. Определение активности α-гликозидазы позволяет судить о функционировании половых желёз. Например, снижение определяемой активности α-гликозидазы в семенной жидкости свидетельствует о дисплазии эпидидимиса [6].

Целью нашего исследования является разработка методологического подхода к подготовке биологического материала для изучения свойств ферментов, выделенных из семенной жидкости крысы и обладающих амилолитической активностью.

Для подробного изучения ферментного состава биологических жидкостей применяют различные методы обогащения проб. Среди них наиболее популярными являются высаливание, диализ, гель-фильтрация и электрофорез.

Метод диализа позволяет, используя полупроницаемую мембрану, удалить из пробы низкомолекулярные примеси. Метод гель-фильтрации основывается на разделении веществ по размеру за счет различия в их способности проникать в поры. Метод высаливания основан на осаждении определенных групп белков из раствора, при добавлении к нему солей щелочных, щелочноземельных металлов и некоторых других веществ. Серьезными преимуществами метода являются его простота и возможность восстановления активности белка при удалении соли из раствора.

Электрофоретический метод исследования основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле. Явным преимуществом метода является возможность, как качественной, так и количественной оценки белкового состава пробы.

В данном исследовании решено применить сочетание методов электрофореза с предварительной подготовкой проб высаливанием, так как такая комбинация позволяет удалить из пробы большую часть протеинов, не относящихся к исследованию [5].

Также на изменение активности ферментов влияет среда выделения, в частности применение растворов хлорида натрия увеличивает активность амилолитических ферментов [7, p. 238-246].

Эксперимент проводился на 4 самцах крыс линии Wistar. В качестве объекта исследования использовали секрет семенных пузырьков, который смешивали с 0,9%-й водным раствором хлорида натрия и центрифугировали 10 минут при скорости 2500 об/мин для отделения жидкой фракции.

Из каждой пробы отбирали по 4 аликвоты для исследования. Добавляли в каждую порцию сульфат аммония так, чтобы в конечном растворе его концентрация составляла 20, 30, 40 и 60% соответственно. После экспозиции в течение 30 минут пробы центрифугировали для отделения осадка. Затем определяли содержание общего белка в каждой пробе методом Лоури [8, p. 265-275].

Амилолитические ферменты разделяли с помощью электрофореза в полиамилакридном геле [3, c. 12-14]. В качестве субстрата для энзиматической реакции использовали 1% раствор крахмала, которым заменяли воду в составе геля. Внесение проб в лунки геля производили из расчёта 10 мкг белка на 1 мм² геля. После проведения разделения гелевые пластинки извлекали и инкубировали в течение 15 минут при температуре 37°С в буфере с pH=5.6 [4]. Затем промывали и окрашивали раствором йода в йодистом калии в течение 3 минут. При взаимодействии крахмала с раствором йода пластинка окрашивалась в тёмно-фиолетовый цвет, а места локализации амилолитических ферментов, в которых происходило разрушение крахмала, оставались неокрашенными. После этого гелевую пластинку промывали дистиллированной водой и сканировали.

После окрашивания йодом на гелевой пластинке остались фрагменты, не имеющие окраски, или окрашенные менее выражено, чем сама пластинка. Эти светлые пятна обусловлены работой амилолитических ферментов. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна количеству фермента и определялась с помощью денситометра. Результаты исследования представлены на рисунке (рис.).

Рис. Распределение фракций амилолитических ферментов после электрофореза в ПААГ (окрашивание йодом в иодиде калия): 1 – надосадочная фракция после высаливания 20% раствором сульфата аммония; 2 – надосадочная фракция после высаливания 30% раствором сульфата аммония; 3 – надосадочная фракция после высаливания 40% раствором сульфата аммония; 4 – надосадочная фракция после высаливания 60% раствором сульфата аммония

Как видно на изображении, амилолитические ферменты обнаруживаются в трёх фракциях. При этом представительство низкомолекулярной фракции выше (более светлые пятна ниже по ходу движения белков). Также наблюдается чёткая зависимость изменения активности от пробоподготовки. Наибольшая активность ферментов выявлена при обработке пробы раствором сульфата аммония 40%-концентрации в конечном растворе. В пробах, обработанных раствором сульфата аммония 60%-концентрации в конечном растворе, активность амилолитических ферментов не выявлена, что может быть связано с их полным высаливанием из раствора.

Так как в каждую лунку загружался биологический материал, содержащий одинаковые порции белков, можно сказать, что увеличение активности ферментов не зависит от количества общего белка. Это происходит за счёт обогащения пробы при высаливании, т.е. за счёт удаления белков, не обладающих амилолитической ферментативной активностью.

Для выявления точных показателей содержания белков в полученных фракциях было проведено денситометрическое исследование, в котором активность ферментов оценивалось по оптической плотности осветлённого участка геля.

По результатам денситометрии видно, что активность высокомолекулярных фракций после высаливания меняется незначительно, а активность фракции со средней и низкой молекулярной массой увеличивается каждый раз после каждой процедуры высаливания примерно в 2 раза. Результаты денситометрии представлены в таблице (табл.).

Таблица

Оптическая плотность фракций амилолитических ферментов, у.е.

Оптическая плотность пятна, соответствующего высокомолекулярной фракции, изменялась незначительно, что указывает на потерю при высаливании белков этой фракции, обладающих амилолитической активностью, наряду с другими белками. Это может быть связано с тем, что данная фракция представлена несколькими амилолитическими ферментами, обладающими различными физико-химическими свойствами, что позволило отсеить часть белков во время высаливания. При последовательном повышении концентрации сульфата аммония, эти ферменты поочередно выпадают в осадок, изменяя состав данной фракции.

Таким образом, установлено, что высаливание, в качестве пробоподготовки, позволяет изменить соотношение фракций амилолитических ферментов и может быть использовано для оценки белкового состава ферментов, проявляющих амилолитическую активность.

Применение методов очистки и обогащения проб является практически выгодным этапом в подготовке проб к анализу, так как позволяет существенно повысить чувствительность методов. Наиболее подходящими условиями для подготовки семенной жидкости к исследованию содержащихся в ней амилолитических ферментов является высаливание части белков раствором сульфата аммония в конечной концентрации 40% с последующим пересчётом количества вносимой пробы относительно конечной концентрации общего белка.