Введение
В НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи было разработано новое антибактериальное средство фтортиазинон (ФТ). Оно является ингибитором АТФазы системы секреции третьего типа, которая встречается у многих грамотрицательных бактерий. Доклинические исследования ФТ показали его терапевтическую активность против Actinetobacter baumanii [1], Salmonella enterica [2, 3] и Pseudomonas aeruginosa [4]. При этом важным этапом при разработке новых лекарственных средств является оценка фармакокинетики (ФК). Знание ФК параметров вещества позволяет оценить выбор лекарственной формы, распределение по органам, интенсивность проникновения препарата в ткани и охарактеризовать пути его элиминации – все это необходимо для прогнозирования действия фармакологического средства у человека [5]. Поэтому была разработана ВЭЖХ-МС/МС методика количественного определения ФТ, которая была применена для доклинического исследования ФК и тканевой доступности ФТ у мышей.
Объекты и методы исследования
1. Лабораторные животные
В эксперименте были использованы мыши (самцы) линии DBA, массой 24-26 г. Все манипуляции с животными были проведены с разрешением этического комитета в ФГБУ «НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Животные получали препарат посредством принудительного выпаивания через желудочный зонд в виде суспензии вещества в воде в дозе 400 мг/кг по действующему веществу. Изучение процессов распределения препарата ФТ проводили в цельной крови, печени, почках и легких через 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 12,0; и 24,0 ч после дачи препарата.
2. Реагенты и материалы
В качестве подвижной фазы А был использован 0,1% водный раствор муравьиной кислоты, в качестве подвижной фазы Б – ацетонитрил. Для приготовления калибровочных стандартов и образцов контроля качества была использована субстанция ФТ (4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид), в качестве внутреннего стандарта была использована субстанция CL-130 (4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-трифторфенил)-карбоксамид), предоставленные ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи».
Рабочий раствор ФТ был получен растворением субстанции в ацетонитриле и последующим разбавлением его ацетонитрилом для получения раствора с концентрацией 10 мкг/мл. Далее рабочий раствор был использован для получения 10 уровней калибровочных стандартов с концентрациями 0,1; 1,0; 5,0; 10,0; 50,0; 100,0; 200,0; 300,0. Аналогично был приготовлен рабочий раствор ФТ для образцов контроля качества, который был использован для получения 3 образцов контроля с концентрациями 0,3; 150,0 и 250,0 нг/мл.
Внутренний стандарт CL-130 был приготовлен растворением точной навески в метаноле для получения раствора с концентрацией 100 мкг/мл, затем полученный раствор был разбавлен ацетонитрилом для получения рабочего раствора внутреннего стандарта с концентрацией 1000 нг/мл.
3. Пробоподготовка
В пластиковую пробирку помещали 10 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта, 100 мкл анализируемого биобъекта (гомогенат органа или цельная кровь), 400 мкл ацетонитрила и перемешивали. Далее пробу центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость для дальнейшего упаривания досуха. Сухой остаток перерастворяли в 100 мкл ацетонитрила и переносили в микровиалы для последующего хромато-масс-спектрометрического анализа.
4. Хромато-масс-спектрометрический анализ
Для анализа был использован жидкостной хроматограф Agilent 1290 Infinity, объединенный с масс-спектрометрическим детектором Agilent 6470 (Agilent Corporation, США). Была использована аналитическая колонка Acquity UPLC BEH C18 (2,1 × 50 мм; 1,7 мкм) фирмы Waters Corporation, США. Температура колонки – 40 °C, скорость потока подвижной фазы – 0,3 мл/мин, градиент – 0,1 мин (10% B); 3,0 мин (55% B); 4,1 мин (90% B); 5,1 мин (10% B). Объем вводимой пробы – 3 мкл, общее время анализа – 7,0 мин. Масс-спектрометрический анализ был проведен в электроспрее в положительной области в режиме мониторинга множественных реакций.
5. Количественное определение ФТ
Исходные хромато-масс-спектрометрические данные были обработаны при помощи программного комплекса Masshunter (Agilent Corporation, США). Математическая обработка была проведена при помощи программы «Excel 2013», основные ФК параметры были рассчитаны при помощи программы «PKSolver». Статистическая обработка результатов отсутствует, поскольку на каждую временную точку было использовано по 5 животных, и ФК кривая построена по усредненным концентрациям.
Результаты и обсуждение
Была разработана высокочувствительная методика количественного определения нового антибактериального средства ФТ, которая была использована для проведения доклинического исследования препарата в цельной крови и гомогенатах органов мышей. Было установлено, что ФТ определялся в биообразцах в течение 24 часов. Кинетика препарата в крови носит ярко выраженный двухфазный характер. В крови время достижения первого пика концентрации (Cmax1 = 1,82 нг/мл) составило 1,0 ч. Далее концентрация падает и достигает своего второго максимального по значению пика (Cmax2 = 2.93 нг/мл) через 4,0 ч после дачи препарата. Расчет ФК параметров показал, что в крови площадь под фармакокинетической кривой AUC0→t составила 21,5 нг/мл×ч, скорость всасывания (Cmax/AUC0→t) составила 0,137 ч-1, период полувыведения ФТ – 8,67 ч, среднее время удерживания вещества в организме (MRT) равно 7,9 ч. Полученные данные указывают на медленное всасывание и длительное нахождение ФТ в организме.
В печени и почках, как и в крови, наблюдается двухфазный характер кинетики препарата. В легких кинетика препарата однофазная. Абсолютные значения тканевой доступности (AUC0→tоргана/AUC0→tкрови) увеличиваются в ряду: легкие – почки – печень. При этом, показатели периода полувыведения и среднего времени удержания в легких достигают наибольших значений. Это может свидетельствовать о том, что препарат накапливается в данном органе.
Наблюдаемая двухфазная кинетика ФТ в крови и некоторых органах (печень, почки) в литературе носит название «феномен двух пиков» и описана для ряда соединений [6, 7]. Существует несколько объяснений такого явления, в частности, описано влияние кишечно-печеночной циркуляции на фармакокинетику лекарственных средств [8]. Таким образом, препарат может циклично подвергаться реабсорбции с желчными кислотами, что может объяснить наличие двух пиковых значений концентрации. Также в пользу этого довода говорят те факты, что площадь под фармакокинетической кривой в печени максимальна среди других исследованных органов, а период полувыведения – минимальный.
Заключение
Была разработана высокочувствительная методика количественного определения нового антибактериального средства ФТ, которая была использована для проведения доклинического исследования препарата у мышей. Было выявлено, что исследуемый препарат медленно всасывается и накапливается в организме, концентрируясь преимущественно в легких, что можно рассматривать как подходящие ФК свойства для препарата антибактериальной терапии против синегнойной палочки.
